Для начала разрежьте фильтровальную бумагу на прямоугольную форму примерно 17 на 20 миллиметров и удалите четыре угла. Затем создайте примерно семь на 10 миллиметров полого центра в фильтровальной бумаге. Прикрепите имеющееся в продаже кольцо к слою гибкой пленки и создайте полый центр в слое гибкой пленки.
Подготовленное кольцо поместите в 35-миллиметровую чашку Петри. После предварительного культивирования извлеките яйцо из инкубатора и поместите его по длинной оси на картонный лоток для яиц. Очистите всю поверхность яичной скорлупы 70% этанолом и дайте ей отдохнуть в течение 15 минут.
Держите яйцо за его короткую ось и разбейте его на дне. Откройте яйцо над чистой 100-миллиметровой чашкой Петри, чтобы извлечь его содержимое. С помощью пипетки перенесите примерно 10 миллилитров тонкого альбумина в 15-миллилитровую пробирку для экстра яйцеклетки.
Заполните центр чашки для культуры тонким альбумином. С помощью папиросной бумаги аккуратно удалите густой альбумин, прикрепленный к вителлиновой мембране эмбриона. Теперь осторожно прикрепите фильтровальную бумагу к мембране vitelline, убедившись, что ось тела эмбриона совмещена с центральным прямоугольником на фильтровальной бумаге.
Разрежьте ножницами мембрану, окружающую фильтровальную бумагу. С помощью пинцета аккуратно оттяните изолированную фильтровальную бумагу от кокетки в косом направлении. Переверните фильтровальную бумагу вверх дном, чтобы расположить эмбрион тыльной стороной вниз.
Осторожно погрузите всю фильтровальную бумагу с одной стороны длинной оси в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую моющее средство. С помощью чистой пипетки аккуратно распылите промывочную среду параллельно фильтровальной бумаге, чтобы удалить остатки желтка. Затем осторожно удалите фильтровальную бумагу из промывочной среды и используйте папиросную бумагу, чтобы впитать излишки среды с краев эмбриона.
Положите фильтровальную бумагу с эмбрионом на чашку для культивирования так, чтобы спинная сторона эмбриона была обращена вниз. Перенесите чашку для культивирования в инкубатор на сцене для экстра ово культуры. Залейте посуду культуры теплым средством для мытья.
Когда эмбрион достигнет желаемой стадии развития, перенесите фильтровальную бумагу с эмбрионом в чашку для культивирования, заполненную промывочной средой. Поместите чашку с культурой в инкубатор микроскопа Бриллюэна. Для процесса калибровки измерьте сигнал Бриллюэна воды.
Затем измерьте сигнал Бриллюэна для метанола. При получении изображений в светлом поле с четырехкратным объективом отрегулируйте точку лазерного излучения на вторую пару сомитов. Затем переключитесь на объектив с 40-кратным увеличением и выполните точную настройку лазерной точки до середины нервной трубки.
Разблокируйте лазерный луч и отрегулируйте фокальную плоскость. Отсканируйте эмбрион с помощью двумерного трансляционного этапа и получите изображение интересующей области по методу Бриллюэна. После завершения сканирования осторожно снимите фильтровальную бумагу с эмбрионом.
Используйте папиросную бумагу, чтобы впитать излишки промывочной среды из эмбриона. Поместите эмбрион обратно в чашку для культивирования, наполненную тонким альбумином, для непрерывного культивирования. Для реконструкции изображения Бриллюэна загрузите данные сигнала воды и метанола.
Нажмите set region и выберите регион с четырьмя точками для вычисления параметров калибровки. Сохраните результаты калибровки. Загрузите данные сканирования эмбрионов и нажмите «Пуск» для обработки параметров.
Наконец, восстановите 2-D изображение Бриллюэна на основе сдвигов Бриллюэна всех пикселей. Сдвиг Бриллюэна в расчетном продольном модуле нервной пластинки в зависимости от числа сомитов и времени инкубации показал увеличение сдвига ткани по Бриллюэну во время закрытия нервной трубки.
