Для начала поместите стерилизованные на поверхность семена Arabidopsis thaliana Col-0 на пластину со средой для проращивания семян. После двух дней холодной стратификации переместите пластину в комнату для выращивания, установленную при температуре 21 градус Цельсия с длинным световым днем и влажностью 50%. Перенесите недельную рассаду в ящик для растительных культур со средой для роста растений.
Выращивайте культуру Agrobacterium tumefaciens в среде LB до тех пор, пока она не достигнет оптической плотности на уровне 600 нанометров 0,9 к 1. С помощью иглы, установленной на инсулиновом шприце, введите примерно 50 микролитров бактериальной культуры у основания первичного соцветия одномесячного ростка арабидопсиса. Поцарапайте шприцем ткань на поверхности первичного стебля.
Через две-четыре недели иссеките появляющиеся волосистые корни и культивируйте их на чашке Петри со средой для роста волосистых корней с добавлением антибиотиков для подавления роста агробактерий. Культивируйте волосатый корень при температуре 24 градуса Цельсия в темное время суток. Через одну-две недели индивидуализируйте волосистые корни на пластине с помощью среды для роста волосистых корней и переносите выбранные волосистые корневые линии в свежую среду каждые четыре-пять недель.
Перенесите волосистые корни на пластину со средой для регенерации, чтобы вызвать образование каллюса, и культивируйте при температуре 21 градус Цельсия в течение длинного светового дня. Как только побеги появятся из каллюса, обрежьте побеги и перенесите их в среду для удлинения побегов на две-три недели, чтобы способствовать росту и удлинению. Затем переложите вытянутые побеги в корневую индукционную среду.
Наконец, перенесите укоренившееся растение в почву для выполнения трансгенной селекции. У A.thaliana желтые каллусы индуцировались в течение 14 дней во всех испытуемых волосистых корневых линиях. Первые побеги зачатков, заметные в виде темно-зеленых пятен, появились уже через три недели после переноса в среду для регенерации.
Через четыре недели побеги покрыли волосистые корни на 90% линий, а в некоторых случаях наблюдалось случайное образование корней. Однако одна линия не восстановилась даже через три месяца. По сравнению с диким типом, регенеранты волосистых корней A. thaliana демонстрировали карликовый фенотип с плотной корневой системой, морщинистыми листьями и измененным временем цветения.
