Для начала запустите программное обеспечение системы анализа живых клеток. Нажмите на символ плюса в верхнем левом углу экрана, чтобы запустить добавление сосуда. Выберите «Сканировать по расписанию», затем нажмите «Создать», чтобы запустить программу сканирования.
Выберите Стандартный. Затем установите параметры сканирования для каждой ячейки на Нет, а каналы изображения на Фаза, Зеленый и Красный, с соответствующим временем сбора. Установите цель на 20x.
Из списка выберите пластину и выберите место расположения сосуда, чтобы поместить пластину на лоток системы визуализации. Выберите лунки с образцами и определите количество изображений для съемки в каждой скважине. Эта информация автоматически генерирует предполагаемую продолжительность сканирования пластины.
Щелкните Создать карту пластин, чтобы ввести информацию для каждой скважины, такую как тип ячейки и соединение. Затем назовите исследование. На следующем экране выберите Basic Analyzer в качестве типа анализа и выберите Analysis Definition из выпадающего списка, в котором отображаются ранее использованные определения анализа.
Оставьте спектральное несмешивание для зеленого и красного на 0,0. Запланируйте сканирование каждые 15–20 минут в течение восьми часов. Перетащите бело-серую полосу в верхнюю часть экрана, чтобы установить время начала сканирования.
На следующем экране проверьте настройки сканирования и нажмите «Добавить в расписание», чтобы начать сканирование. После сканирования на вкладке Вид откройте сосуд для анализа. Нажмите кнопку «Запустить анализ» в левой части экрана и выберите «Создать новое определение анализа».
Выберите «Базовый анализатор» и используйте каналы изображения «Фаза», «Зеленый», «Красный» и «Перекрытие». Выберите от шести до восьми репрезентативных образцов изображений для обучения. Чтобы настроить определение анализа, установите зеленые объекты для нейтрофилов, образующих нейтрофильные внеклеточные ловушки или НВЛ, а красные объекты для ядер всех нейтрофилов.
Нажмите «Предварительный просмотр текущего» или «Предварительный просмотр всех» и настройте каждый параметр для оптимизации результатов. Выберите время сканирования и лунки для анализа. Затем укажите метку для определения анализа.
Просмотрите сводку и запустите анализ. После анализа дважды щелкните по названию определения анализа, чтобы открыть анализируемое исследование. Откройте Слои в левой части экрана и проверьте, правильно ли отмечена каждая ячейка.
Нажмите «Метрики графика» в левой части экрана, затем выберите «Количество на изображение» в качестве зеленого счетчика. Выберите временные точки и скважины для экспорта. Для выбранной группировки выберите Plate Map Replicates, чтобы убедиться, что все скважины правильно указаны во время сканирования, и нажмите Export Data.
Аналогичным образом экспортируйте данные для количества красных и перекрывающихся чисел. Используя приведенное уравнение, вычислить процент образующих ячеек НЭО для каждого условия и временной точки. Временной ход формирования НВЛ визуализируется путем построения графика процентного соотношения нейтрофилов, образующих НВЛ, в каждой временной точке.
Добавление ингибитора AKT блокировало образование НВЛ в нейтрофилах, стимулированных PMA или ионофором кальция. Демонстрация потенциальных молекул, нацеленных на образование НВЛ, может быть протестирована с высокой пропускной способностью с использованием данной методологии.
