Создание навигационной карты для CLEM и подготовка ультратонких срезов для электронной микроскопии

Для начала возьмите ультратонкий срез ткани мозга мыши, экспрессирующий mScarlet. Добавьте 10 микролитров монтажного буфера на ультратонкую секцию на защитном стекле и поместите новое чистое защитное стекло на монтажный буфер. Поместите два защитных стекла с ультратонкой частью в камеру визуализации.

Найдите срез с помощью маркера кольца в режиме визуализации яркого поля инвертированного флуоресцентного микроскопа и переместитесь в один угол разреза. Включите белый свет и сделайте снимок яркого поля. Затем выключите белый свет.

Активируйте лазер и получите флуоресцентные изображения с тем же полем зрения. Деактивируйте лазер и переместитесь в соседнее поле зрения с перекрытием 10%. Захват яркого поля и флуоресцентного изображения второго поля зрения и запись траектории изображения для сшивания поля зрения.

Теперь используйте навигационную карту, чтобы нацелиться на интересующие ячейки. Активируйте лазер и сделайте 300 кадров флуоресцентных изображений интересующей клетки. Затем выключите лазер.

После этого активируйте белый свет и сделайте около 100 последовательных изображений яркого поля. Чтобы подготовить срезы для электронной микроскопии, наполните стеклянную банку водой двойной дистиллированной воды. Снимите защитные стекла, удерживающие ультратонкие срезы, с камеры визуализации и отделите их пинцетом.

Зажмите покровное стекло секцией. Смойте монтажный буфер двойной дистиллированной водой и дайте ему высохнуть. Используя одностороннее лезвие, нарежьте гашиш вокруг ультратонкого участка.

Капните 10 микролитров 12%-ной плавиковой кислоты в каждый угол насечки. Медленно опустите покровное стекло в воду. Затем всплывите пленку Pioloform и ультратонкий срез на поверхности воды.

Поместите сетку прорезей без покрытия на секцию, чтобы захватить ее в центре сетки. Накройте предметное стекло параформой. Подберите сетку с пленкой Pioloform и дайте ей высохнуть на воздухе при комнатной температуре.