Культивирование H9-эмбриональных стволовых клеток для получения нервной сетчатки человека

Для начала добавьте по одному миллилитру 1% внеклеточного матрикса в каждую лунку шестилуночной пластины. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Через час добавьте в каждую лунку два миллилитра предварительно прогретой поддерживающей среды, содержащей 0,4 микромоляра Y-27632.

Чтобы разморозить эмбриональные стволовые клетки H9, встряхните криовиальный запас на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 секунд. Тщательно простерилизуйте криовиал с помощью 75% дезинфицирующего спиртового спрея. Затем переложите размороженные клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую поддерживающую среду и Y-27632.

Центрифугируйте пробирку при 190 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем осторожно удалите большую часть надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре поддерживающей среды, содержащей Y-27632. Дозируйте 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку пластины, покрытой внеклеточным матриксом, содержащей поддерживающую среду.

Встряхните планшет в сторону и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при углекислом газе 5% в течение не менее 24 часов. Меняйте среду каждый день. Как только плотность клонов достигнет 70%, удалите отработанную среду.

После промывки 2D PBS инкубируйте клетки с одним миллилитром ЭДТА в течение четырех-семи минут при комнатной температуре и полностью выбросьте ЭДТА. Добавьте в ячейки один миллилитр поддерживающей среды и слегка постучите по пластине. Затем перенесите выбитые клетки в 15-миллилитровую пробирку и перемешайте их три-пять раз.

Добавьте от 20 до 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку предварительно подготовленной посуды, покрытой ECM, и хорошо перемешайте. С помощью микроскопа подтвердите плотность клеток и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа.