Для начала ресуспендируйте синтезированный пептид, который действует как положительный контроль, в концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр в ДМСО. Смешайте ресуспендированный пептид с биотинилированным пептидом гистона H4 для создания стандартной кривой. Затем соберите реакции ацетилирования в двух экземплярах в 96-луночные ПЦР-планшеты.
20-микролитровая реакция должна включать 10 микролитров фермента, один микролитр пептида H4, один микролитр 20-кратного буфера и один микролитр DTT. Добавьте один микролитр ДМСО или исследуемого соединения в каждую лунку. Аккуратно пипеткой смешайте смесь.
Затем инкубируйте смесь на льду в течение 10 минут, чтобы обеспечить комплексообразование ингибиторов ферментов. Для продолжения реакции ацетилирования соедините два микролитра коэнзима А 4-пентенового масла с четырьмя микролитрами воды. Добавьте в лунки шесть микролитров этой смеси.
После аккуратного перемешивания центрифугируйте смесь при 300 г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Инкубируйте содержимое при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа в закрытых пробирках. Погасите содержимое 20 микролитрами восьмимолярной мочевины и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшей обработки.
Затем пипеткой закапывают 80 микролитров ПБСТ в каждую лунку предварительно заблокированных черных 96-луночных планшетов с покрытием NeutrAvidin. Добавьте 40 микролитров реакционного содержимого в лунки планшета. Затем пипеткой стандартные кривые пептиды в двух экземплярах в оставшиеся лунки.
Осторожно перемешайте пептиды на орбитальном шейкере в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы облегчить связывание. После завершения связывания отсасывайте жидкость из лунок. Используйте пластинчатую мойку, чтобы промыть колодцы 200 микролитрами PBST.
Для клик-реакции добавьте смесь меди THPTA к аскорбату натрия в воде и азиду биотина в ДМСО. В каждую лунку выдавите 19 микролитров свежесмешанных реагентов. Запечатайте пластину алюминиевой фольгой.
Затем выдержите его при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Отсасывайте раствор из лунок перед промывкой, как и раньше. Далее в каждую лунку добавляют по 100 микролитров разбавленной смеси пероксидазы хрена стрептавидина.
Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа при легком перемешивании на орбитальном шейкере. Для совмещения реагентов детектирования Amplex Red в реактив Amplex Red необходимо внести 500 микролитров разбавленной перекиси водорода. Добавьте 50 микролитров этой смеси к 4,5 миллилитрам фосфата натрия.
Пипеткой 100 микролитров реакционной смеси Amplex Red в промытые лунки. Затем выдержите планшет при комнатной температуре в течение 30 минут вдали от света. Запустите программное обеспечение SmartControl и нажмите Plate Out.
После того, как пластина будет перенесена в инструмент, нажмите на иконку Amplex Red и измените расположение пластины. Нажмите значок Amplex Red еще раз, чтобы увидеть измененный макет. Затем выберите верхние левые стандартные колодцы из компоновки.
Измените имя файла и нажмите кнопку «Начать настройку». После того, как усиление установлено, нажмите «Начать измерение». Нажмите Current State, чтобы наблюдать за измерением в реальном времени.
После завершения измерения закройте вкладку. Затем нажмите «Открыть последний запуск» на верхней панели. Перейдите на вкладку Mars.
Затем нажмите «Экспорт в Excel» в главном меню, чтобы экспортировать результаты данных. Было замечено, что соединения А и С ингибируют активность HAT1 почти на 100% в течение нескольких разведений.
