Для начала возьмем бедренные, большеберцовые, тазовые и плечевые кости, выделенные от мыши. С помощью скальпеля прорежьте ростовые пластинки длинных костей, удаляя эпифиз. Поместите его в 10-сантиметровую посуду со средним M199 плюс 2% FBS на льду.
Затем используйте иглу 28-го калибра и 10-миллилитровый шприц, наполненный средой M199 плюс 2% FBS, чтобы промыть костный мозг в 15-миллилитровую трубку со льдом. Поместите промытую косточку в блюдо с эпифизом. Оставьте 15-миллилитровую трубку вертикально на льду, пока костный мозг не осядет.
Затем удалите среду M199 плюс 2% FBS Добавьте четыре миллилитра диссоциационного коктейля B&M в 15-миллилитровую пробирку и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации соберите надосадочную жидкость и профильтруйте через 70-микрометровый клеточный фильтр в холодную 50-миллилитровую пробирку. Добавьте два миллилитра свежего диссоциационного коктейля B&M к оставшейся грануле костного мозга и верните ее на водяную баню.
С помощью пипетки объемом в один миллилитр энергично пипетируйте все оставшиеся кусочки костного мозга. Соберите всю клеточную суспензию в ту же пробирку, что и раньше. Добавьте в клеточную суспензию 20 миллилитров среды M199 с 0,5% БСА и двухмиллимолярной ЭДТА.
После этого центрифугируйте клетки при температуре 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS с 0,5% БСА и антителами к биотину. Выдерживать на орбитальном шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте.
Далее тщательно проведите вихревую обработку магнитных шариков. Добавьте в пробирку 25 микролитров шариков и снова инкубируйте на орбитальном шейкере. Поместите пробирку в подходящий магнит на две-три минуты и соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
Разломайте косточки на более мелкие кусочки в 10-сантиметровой посуде с помощью плоского колпачка 50-миллилитровой трубки. Отфильтруйте надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 70 микрометров, чтобы изолировать костные фрагменты. Разрежьте ножницами костные отломки в ячейке ситечка.
Поместите фильтр с костными фрагментами на 50-миллилитровую трубку и откройте фильтр скальпелем. С помощью пинцета перенесите костную фракцию в пять миллилитров мышиной диссоциативной смеси B&M. Затем поместите трубку горизонтально на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 120 об/мин, встряхивая в течение 30 минут.
После разложения добавьте 25 миллилитров среды M199 с 0,5% BSA и двухмиллимолярной ЭДТА. Отфильтруйте надосадочную жидкость, содержащую стромальные клетки, через 70-микронный клеточный фильтр в холодную 50-миллилитровую пробирку.
