Начните с загрузки незаточенных полукарт апо-енолазы из дополнительных данных в EMDB. Затем откройте ChimeraX и нажмите «Открыть» на панели инструментов. Выберите полукарты апоэнолазы.
Введите это в командной строке, чтобы объединить полукарты и получить незаточенную карту апо-енолазы. Установите пороговое значение карты на 0,0595 для уменьшения шума. Затем введите эту команду, чтобы переименовать объединенную карту.
Нажмите «Открыть». Выберите незаточенные полукарты PEP enolase и введите эту команду в командной строке. Установите пороговое значение карты на 0,0721, чтобы уменьшить шум, и переименуйте карту.
Затем отобразите карты апо-енолазы и PEP-енолазы без резкости и нажмите «По размеру» на панели «Карта», чтобы вычислить карту различий. Введите эту команду в командной строке, чтобы вычесть карту енолазы PEP из карты апо-енолазы и настроить пороговое значение. Раскрасьте вычитаемую карту в зеленый цвет, обозначая положительную плотность.
Далее откройте PDB и загрузите координаты октамерной енолазы микобактерий туберкулеза. Затем в ChimeraX нажмите «Открыть» на панели инструментов и выберите имя файла. Нажмите «Отобразить молекулы», «Скрыть атомы» и «Показать мультфильм».
Введите эту команду, чтобы переименовать модель. Выберите модель на панели «Модель». Кликните правой кнопкой мыши на панели инструментов.
Затем нажмите кнопку Переместить модель и расположите модель в непосредственной близости от карты енолазы PEP. Выровняйте модель относительно карты. Подгоните эту модель в карту PEP enolase unsharpened, введя эту команду в командной строке.
Проверьте посадку. Настройте отображение цвета и структуры. Откройте Coot из терминала, набрав coot&Click на File, затем Open Coordinates и выберите Apo-enolase.pdb.
Затем загрузите карту заточения связанной энолазы PEP из EMDB. Отобразите эту карту в Coot, нажав на «Файл» и «Открыть карту». Прокрутите среднюю кнопку мыши, чтобы установить порог на 7,00 сигма.
Нажмите на Validate, затем Unmodeled Blobs. В новом окне введите 7.00 в качестве RMSD и нажмите кнопку Найти большие двоичные объекты. Найдите несмоделированную плотность лиганда рядом с остатками активного центра, серином 42, лизином 386 и аргинином 364.
Затем нажмите «Файл», «Получить мономер» и введите PEP, чтобы получить файл модели мономера PEP из библиотеки Coot Monomer Library. Переместите молекулу PEP на плотность, используя опцию Rotate Translate Zone Chain Molecule в меню боковой панели. Затем нажмите на Real Space Refined Zone в меню боковой панели, чтобы вписать молекулу PEP в плотность.
Оцените посадку и нажмите «Принять», когда закончите. Используйте опцию Merge Molecule на вкладке Edit, чтобы объединить подогнанный лиганд с моделью апо-енолазы и сохранить модель как PEP enolase.pdb. Затем нажмите «Рассчитать», «Инструменты NCS», а затем «Лиганды NCS», чтобы добавить лиганды к остальным мономерам в файле координат.
Для опции белок с NCS выберите файл координат апо-енолазы. pdb и идентификатор цепи A в качестве мастер-цепи NCS. Далее для молекулы, содержащей лиганд, выберите апо-енолазу.
pdb в качестве файла координат, идентификатора цепочки J и номера остатка 121. Нажмите на кнопку «Найти кандидатские позиции». Нажмите на отдельные лиганды-кандидаты и проанализируйте их подгонку визуально.
Затем смоделируйте два иона магния в плотности активного центра, нажав на Place Atom на указателе и выбрав MG из списка Pointer Atom Type. Кроме того, добавьте ионы магния в мономера, связанные с симметрией. Оцените соответствие атомов магния, связанных с симметрией.
Сохраните модель, нажав на «Файл», затем «Сохранить координаты». Выберите имя файла и введите enolase plus PEP плюс MG.pdb. Затем откройте графический интерфейс Phoenix.
Запустите задание на уточнение реального пространства с параметрами по умолчанию с сохраненной моделью и ограниченной картой повышения резкости PEP. Чтобы визуализировать смоделированный лиганд, откройте PyMOL, нажмите «Файл» и «Открыть», чтобы загрузить уточненную модель из задания уточнения Phoenix. Также загрузите карту повышения резкости с границами PEP.
Переименуйте карту в PEP, заточенную, нажав на «Действия», а затем «Переименовать». Затем выберите лиганды, нажав «Дисплей», а затем «Последовательность». Введите это в командную строку и нажмите Enter.
Это позволяет вырезать плотность карты вокруг выделенной области. Нажмите на последнее поле, C, рядом с mesh_ligand объектом, чтобы изменить цвет лигандной сетки на синий. Отобразите остатки активного центра, взаимодействующие с ПЭП и ионами магния в представлении стиков и сфер, а фермент анолазу — в мультяшном представлении.
Установите размер сетки. Введите это в командную строку, чтобы выполнить трассировку лучей и сохранить изображение в формате PNG. Во время гликолиза енолаза превращает два фосфоглицерата в фосфоенолпируват, жизненно важный промежуточный продукт для различных метаболических путей.
Карта различий между ферментом апо и ферментом, связанным с ПЭП, показала отчетливую плотность лиганда. Кроме того, в активном центре моделируемого белка наблюдалась дополнительная плотность. Фосфоенолпируват и два иона магния были смоделированы в плотности, наблюдаемой вблизи лиганда.
Фосфоенолпируват образовывал водородные связи с несколькими остатками активного центра, такими как лизин 386 и аргинин 364. Ионы магния образовывали координационные связи металлов с аспартатом 241, глутаматом 283, аспартатом 310 и фосфатом фосфоенолпирувата.
