Для начала примите 12-дневные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека, которые были подвергнуты индукции нервного гребня. Аккуратно отсасывайте среду С из клеток. Добавьте 100 микролитров PBS на квадратный сантиметр площади поверхности скважины, чтобы промыть ячейки, а затем удалите PBS.
Добавьте к клеткам равное количество раствора для отслоения клеток и инкубируйте в течение 30 минут под 5% добавкой углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в тарелку равный объем среды NCC. Затем с помощью серологической пипетки соберите клеточную суспензию и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Вращайте элементы при температуре 290G в течение двух минут при температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу. Используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров для дозирования 12 миллилитров среды NCC в клеточную гранулу.
Механически пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы создать суспензию. Затем перенесите суспензию ячеек на пластину со сверхнизким уровнем крепления. На 14-й день осторожно покрутите планшеты для клеточных культур, чтобы собрать маленькие сфероиды в центре каждой лунки.
С помощью микропипетки P1000 медленно отсасывайте отработанную среду из окружности каждой лунки. Повторно закормите клетки исходным объемом среды NCC. На 15 день аккуратно удалите среду.
Добавьте PBS в лунки, чтобы промыть сфероиды. Затем удалите как можно больше PBS, убедившись, что сфероиды не потревожены. Далее добавьте 100 микролитров раствора для отслоения клеток на квадратный сантиметр площади поверхности лунки.
Инкубируйте клетки в растворе в течение 30 минут под 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров добавьте в каждую лунку равное количество среды ENC. Механически пипетируйте раствор, чтобы разбить оставшиеся сфероиды.
Затем переложите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования, как и раньше. Затем ресуспендируйте клетки в 5-10 миллилитрах среды ENC.
Подсчитайте концентрацию жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Теперь добавьте достаточное количество среды ENC в пластину от 300 000 до 400 000 жизнеспособных клеток на квадратный сантиметр площади поверхности и плотность около 1 миллиона клеток на миллилитр. Затем отсасывайте растворы из лунок.
Далее добавьте ячейки в пластину с лунками, покрытыми ламинином PO/FN. Подавайте в клетки через день 200 микролитров среды ENC на квадратный сантиметр площади лунки до 30-40 дней. После индукции нервного гребня наблюдались высококачественные свободно плавающие сферы с гладкими поверхностями.
Сфероиды экспрессировали маркер нервного гребня SOX10. Нейриты наблюдались между 25 и 30 днями во время индукции энтеральных нейронов.
