Предварительно подогрейте один миллилитр бульона LB и одну чашку агара LB плюс гентамицин для каждого образца и контролируйте в статическом инкубаторе, установленном при температуре 37 градусов по Цельсию. В комбинированном объеме не более пяти микролитров добавьте от 100 до 200 нанограммов плазмиды-хелпера pTNS2 и инсерционной плазмиды pUC18-Tmini-Tn7-Tlac гентамицина adeIJK к аликвоте электрокомпетентных клеток. Перемешайте легким постукиванием кончиками пальцев, чтобы обеспечить полное смешивание плазмид с электрокомпетентными клетками без образования пузырьков.
Добавьте эквивалентный объем стерильной дистиллированной воды в аликвоту отрицательной контрольной ячейки и осторожно перемешайте, как показано выше. Инкубируйте образцы на льду в течение 20 минут. Перенесите весь образец клетки в ледяную электропорационную кювету, а затем поместите кювету обратно на лед.
Чтобы электропорировать образец ячейки, включите электропоратор и установите его на два киловольта. Протрите поверхность кюветы мягкой тканью, чтобы удалить налипший лед или влагу. Вставьте кювету в электропоратор и подайте удар током.
Сразу же добавьте 0,9 миллилитра предварительно подогретого бульона LB в клетки в кювете и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать клетки со средой. Переложите всю клеточную суспензию в новую пробирку для микрофуги объемом 1,5 миллилитра при комнатной температуре. Затем проверьте значение постоянной времени на электропораторе.
Для достижения наилучших результатов это значение должно быть в диапазоне от четырех до шести. Инкубируйте электропорированные образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа при 250 об/мин, чтобы обеспечить восстановление клеток. Через час распределите 100 микролитров каждого образца на предварительно подогретую пластину с агаром LB plus gentamicin, используя распределитель посева.
Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-18 часов. Проверьте электропорационные пластины. Используя стерильные зубочистки, возьмите до 10 отдельных колоний из пластин с гентамициновым агаром LB plus и наложите их на свежую пластину с гентамициновым агаром.
Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-18 часов. Наложение трансформационных колоний на селективную среду сохраняет трансформированный штамм и обеспечивает исходный материал для ПЦР-скрининга колоний. Продукт ПЦР для скрининговых праймеров, ABglmS2 forward new и Tn7 reverse составляет 382 пары оснований.
Отрицательный контроль реакции включает дикий тип A.baumannii ATCC 17978, AB 258 и отсутствие шаблона.
