Для начала получите осветленный вирус из культивируемых клеток. Поместите ультрацентрифужные пробирки в штатив на выходной стороне многоканального перистальтического насоса. С помощью серологической пипетки осторожно дозируйте 10 миллилитров осветленного вируса в каждую ультрацентрифужную пробирку.
Затем перелейте 22 миллилитра 15%-ной йодиксаноловой фракции в чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Поместите капилляры с правой стороны насоса в трубку и запустите насос. Остановите насос.
Когда йодиксанольная фракция достигнет конца капилляров на выходной стороне насоса, вставьте выходной капилляр в каждую ультрацентрифужную пробирку с осветленным вирусом и запустите насос. Остановите насос, когда последняя часть 15%-ной фракции вот-вот попадет во входные капилляры. Далее перелейте 22 миллилитра 25%-ной йодиксаноловой фракции в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
После включения насоса дайте всей фракции попасть во входные капилляры и остановите насос. При необходимости добавьте еще 60%-ной фракции и заполняйте каждую пробирку до тех пор, пока лизат не образует купол сверху, но не переполнится. Остановите насос и осторожно снимите выходной капилляр.
Закройте пробирку ультрацентрифуги проставкой и загрузите ее в ротор типа 70 TI. После центрифугирования прикрепите ультрацентрифужную пробирку к опорной подставке. С помощью безворсовой салфетки снимите колпачок с пробирки ультрацентрифуги.
Затем прикрепите иглу 20-го калибра к шприцу объемом 5 миллилитров и проникните иглой в стенку пробирки ультрацентрифуги примерно на 3 миллилитра ниже границы раздела 40 и 60% йодиксанола. Медленно аспирируйте границу раздела и часть 40%-ной фракции. Удерживая палец над открытой верхней частью пробирки ультрацентрифуги, вытащите шприц и перенесите аспирированную фракцию AAV в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Наконец, разбавьте аспирированную вирусную фракцию в два раза в лизисном буфере AAV до объема 40 миллилитров. После промывки перистальтической трубки загрузите 20 миллилитров разбавленной фракции AAV в новую ультрацентрифужную пробирку для второго раунда фракционирования.
