Элютирующая эпитопная метка преципитированных белков и иммуноблоттинг для исследований белок-белкового взаимодействия

Центрифугируйте образец белка, помеченный эпитопом, при температуре 5 000 г в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Подождите одну минуту на льду, чтобы бусины выровнялись. Затем выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте в пробирку один миллилитр буфера для лизиса белка, содержащего ингибитор протеазы, и перемешайте содержимое. Вращайте трубку на ротаторе в течение примерно 30-секундных циклов при температуре 4 градуса Цельсия в течение пяти минут. Снова центрифугируйте и поместите пробирку на лед на одну минуту, чтобы выровнять шарики, прежде чем выбросить надосадочную жидкость.

Теперь добавьте 10 микролитров буфера для образцов и кипятите образец при температуре 98 градусов Цельсия в течение 10 минут. Центрифугируйте образец при температуре 5 000 G в течение 30 секунд при температуре 4 градуса Цельсия. Поместите колонку в новую пробирку с низким усвоением белка и перенесите гель в колонку с помощью пипетки с отрезанным наконечником.

Центрифугируйте при 9, 730G в течение одной минуты при 4 градусах Цельсия и соберите поток. Поместите гель в камеру электрофореза и добавьте трис-глицин-SDS-буфер до соответствующего объема вокруг геля. Загрузите образцы элюированного белка в полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия.

Выполняйте электрофорез при напряжении 100 вольт и 400 миллиамперах. Перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида и промокните мембранную кляксу 5%-ным обезжиренным молоком в течение одного часа при комнатной температуре. Трижды промойте мембрану монолауратом полиоксиэтиленсорбитана PBS в шейкере на максимальной скорости в течение пяти минут.

Наконец, инкубируйте мембрану с первичным антителом в течение ночи на шейкере при температуре 4 градуса Цельсия. В трансфицированных клетках HEK 293 иммуноблоттинг подтвердил ассоциацию между DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1 в группах, трансфицированных DYKDDDDK-PRDM16 и HA-EHMT1.