Для начала возьмите горку и добавьте к ней две тонкие полоски двустороннего скотча для подготовки к визуализации. Пипетка нанесет примерно от 10 до 15 микролитров монтажной среды между двумя полосками ленты для крепления мозга. перенесите этикетку мозга дрозофилы на предметное стекло микроскопа с помощью наконечника пипетки P20, предварительно промытого PBS и 0,2% Triton X-100.
Как только мозги будут перенесены, используйте тонкую кисть, чтобы выровнять их, следя за тем, чтобы доли усиков были обращены вверх. После ориентации мозгов накройте их стеклянным покровным стеклом. Затем заполните боковые стороны покровного стекла дополнительным монтажным материалом.
Заклейте края чехла прозрачным лаком для ногтей. После тщательной сушки предметного стекла храните его в холодильнике для последующей визуализации. Для визуализации используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный масляным иммерсионным объективом 63X.
Используйте лазер на основе аргона 488 и гелия неонового 543 для визуализации синаптических клубочков антенны и обонятельных сенсорных нейронов Or42a. Определите оптическое усиление и смещение для обоих каналов. Расположите изображение в центре мозга и сосредоточьтесь на клубочках VM7.
Расположитесь примерно до отверстия в середине мозга. Выберите разрешение изображения 1024 на 1024. Захватите всю конфокальную проекцию Z-стека через антенную долю, чтобы обеспечить захват полной иннервации нейронов Or42a клубочков VM7.
Загрузите слепое изображение генотипа или состояния на Фиджи. Чтобы разделить каналы лазерной линии, перейдите к изображению, нажмите цвет и выберите разделенные каналы. В обонятельном сенсорном канале Or42a прокрутите стек Z, чтобы определить, какие срезы содержат иннервацию нейронов Or42a, определяя начало и конец флуоресценции.
Чтобы создать проекцию суммы срезов, включающую только срезы с иннервацией нейрона Or42a, нажмите на изображение и перейдите к стекам. Затем нажмите Z project, выберите сумму срезов и введите нужный диапазон. Используйте инструмент лассо на Фиджи, чтобы проследить контур иннервации нейрона Or42a в клубочке VM7.
Умножьте окружность трассируемой области на количество срезов стека Z и толщину каждого среза, чтобы рассчитать объем иннервации синаптического клубочка VM7. После 24-часового воздействия контрольного носителя одоранта плотная иннервация Or42a MCD:GFP сохраняется в клубочках VM7 обеих антенных долей. Напротив, 24-часовое воздействие 25%-ного одоранта EB приводит к значительному обрезанию и потере объема синаптического клубочка.
Увеличение концентрации одоранта EB приводит к постепенному усилению обрезки синаптических клубочков. Репрезентативные количественные оценки для этого диапазона концентраций одоранта EB показали аналогичные результаты для интенсивности флуоресценции и объема иннервации.
