Для начала извлеките магнитные шарики для очистки ДНК из холодильника с температурой от двух до восьми градусов Цельсия. Центрифугируйте шарики в течение 10 секунд при температуре 2, 500 г после смешивания. Перенесите лигированный продукт реакции адаптера в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра с низкой абсорбцией.
Добавьте в каждую пробирку по 45 микролитров очищенных магнитных шариков ДНК. После перемешивания компонентов центрифугируйте пробирку в течение 10 секунд, затем поместите пробирку на магнитную решетку на три минуты. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не пипетируя шарики.
Теперь перелейте 300 микролитров 75% свежеприготовленного этанола в каждую микроцентрифугу. Аккуратно поверните трубки четыре раза на 180 градусов. Как только раствор исчезнет, немедленно выбросьте надосадочную жидкость, избегая при этом пипетирования гранул.
Затем кратковременно центрифугируйте пробирки после извлечения пробирок из магнитной стойки. Поместите пробирки на магнитную решетку и пипеткой удалите оставшуюся жидкость. Откройте крышки пробирок микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра и дайте шарикам высохнуть при комнатной температуре в течение пяти минут.
После размораживания и вортексирования реагентов, связанных с ПЦР, центрифугируйте реагенты в течение 10 секунд. Извлеките микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра из магнитного штатива и добавьте в нее реагенты для ПЦР. Кратковременно центрифугируйте вихревую трубку, чтобы избежать попадания капель жидкости на стенку и крышку трубки.
Затем переложите продукт ПЦР в новую пробирку для ПЦР. Инкубируйте на термоамплификаторе и запустите программу амплификации образцов ДНК и CDNA. После инкубации центрифугируйте пробирку для ПЦР в течение 10 секунд и переложите продукт в новую микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра с низкой абсорбцией.
Добавьте 25 микролитров очищенных магнитных шариков ДНК в каждую пробирку и хорошо перемешайте, вортексируя. Центрифугируйте пробирку на низкой скорости и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите пробирки на магнитную решетку на три минуты, пока раствор не исчезнет.
Перенесите надосадочную жидкость в новые микроцентрифужные пробирки, избегая пипетирования гранул. Перелейте 300 микролитров 75% свежеприготовленного этанола в пробирки и промойте шарики два раза с помощью магнитной решетки, как было показано ранее. После краткого центрифугирования пробирок поместите их на штатив и отпижите пипеткой, чтобы удалить оставшуюся жидкость.
Откройте крышки туб объемом 1,5 миллилитра и просушите бусины при комнатной температуре в течение пяти минут. Пипеткой внесите 50 микролитров элюанта в пробирки. Проведите кратковременное центрифугирование после вортексирования пробирок.
Поместите пробирки на магнитную решетку на три минуты, пока раствор не станет прозрачным. Осторожно перелейте жидкость в новую пробирку и пометьте ее названием библиотеки.
