Для начала откройте программу и выберите опцию создания нового файла ДНК. Подготовьте последовательность гена PRRSV из NCBI и нажмите Okay, чтобы сгенерировать файлы последовательностей. Проанализируйте последовательность и отметьте стыки фрагментов.
Определите все соединения, прежде чем разрабатывать конкретные праймеры последовательности для фрагментов. Затем нажмите на Праймеры и выберите Добавить праймер. Вставьте конкретную последовательность и добавьте перекрывающиеся последовательности вектора к первым пяти основным нуклеотидам праймера.
Присвойте имя прямому праймеру и нажмите «Добавить праймер к шаблону», чтобы включить разработанный праймер в шаблон. Затем отметьте места соединения фрагментов и разработайте грунтовку из фрагментов в обратной последовательности. Снова перейдите в раздел «Праймеры» и выберите «Добавить праймер».
Введите заданную последовательность. Добавьте сайт рестрикции к первым пяти простым нуклеотидам. Кроме того, включите от 20 до 40 пар оснований последовательностей выступа вектора к первым пяти основным нуклеотидам сайта рестрикции.
Присвойте имя обратному праймеру и выберите «Добавить праймер в шаблон». Затем настройте шесть отдельных ПЦР-реакций с использованием шести фрагментов и сконструируйте пары праймеров. Проведите ПЦР по трехэтапному протоколу, как показано ниже.
После завершения ПЦР пипетку пипеткой в один микролитр из шести загрузочных буферов xDNA с пятью микролитрами продукта ПЦР. Перемешайте и быстро центрифугируйте. Анализируйте образцы с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.
Чтобы сконструировать полноразмерный ген, вставные фрагменты РРСС амплифицировали с помощью шести ПЦР-реакций. Размеры фрагментов были подтверждены с помощью электрофореза в агарозном геле.
