Начните с подготовки образца с комплексом белок-лиганд. Затем с помощью пипетки осторожно переложить 0,6 миллилитра приготовленного раствора в пятимиллилитровую ЯМР-пробирку. Чтобы настроить ЯМР-прибор на необходимую температуру, используйте команду EDT, чтобы открыть монитор контроля температуры и отрегулировать желаемую температуру.
Затем поместите образец в устройство смены образцов. С помощью автосамплера вставьте образец в магнит и выполните команду sx, за которой следует номер позиции N, соответствующий положению ЯМР-пробирки в лотке автосамплера. После этого образец поступает в магнит ЯМР.
Чтобы зафиксировать сигнал растворителя, введите команду блокировки и выберите соответствующий растворитель в меню. Используйте либо автоматический модуль, atma, либо ручной модуль, atmm, для завершения процесса настройки и согласования. Теперь, используя команду topshim, запустите автоматический шимминг, затем выполните команду pulsecal для определения импульса протона под углом 90 градусов.
После этого создайте новый набор данных и загрузите последовательность импульсов ЯМР STD. Определите резонансные частоты выключения и включения для эксперимента STD NMR в записи FQLIST в окне ACQUPARS. Установите резонансную частоту выключения в области без лигандных или белковых протонных сигналов.
Затем выберите резонансную частоту в спектральной области, лишенной гликановых сигналов. Определите форму импульса, который будет использоваться во время насыщения, в параметрах ACQUPARS окна ASED. После этого установите длину импульса протона 90 градусов, отрегулируйте общее время насыщения и задержку релаксации до трех секунд.
Задайте для параметра количество сканирований значение, кратное восьми, а количество фиктивных сканирований — восемь. Затем установите количество точек в F2 на 16K, 32K или 64K, а на F1 — на два. Теперь с помощью автоматической команды rga установите усиление ресивера, чтобы избежать переполнения.
Рассчитайте общее время эксперимента с помощью команды experiment. Наконец, используйте команду zg, чтобы отправить эксперимент на получение. После эксперимента выполните преобразование Фурье первого FID и выберите место назначения обрабатываемых спектров.
Затем с помощью команды lb отрегулируйте коэффициент уширения линии. Чтобы вручную фазировать спектр, перейдите на вкладку процесса, а затем в подменю регулировки фазы. Нажмите и перетащите соответствующую кнопку, чтобы выполнить коррекцию нуля и первого порядка и сохранить результаты фазирования.
После выполнения преобразования Фурье для второго эксперимента сохраните обработанный спектр с другим кодом. Загрузите два обработанных спектра с помощью нескольких функций и, используя кнопку вычитания, доступную в множественной визуализации, вычтите их. Затем откройте спектр резонанса вне дисплея и выполните команду MD, чтобы запустить окно с несколькими дисплеями.
Затем загрузите спектр STD. Далее проведите сравнительный анализ частот и интенсивностей сигналов, присутствующих в спектре ЯМР СТД. В эксперименте с резонансом в выключенном состоянии измерьте интенсивность сигнала.
Перейдите по меню, чтобы выбрать процесс, а затем выполните интеграцию. Тщательно определите области интереса и запишите интегралы в файл. Аналогичным образом измерьте интенсивности в эксперименте ЯМР ЗППП, убедившись, что используются идентичные параметры, и задокументируйте эти интегралы в отдельном файле.
Кроме того, значения STD могут быть определены путем сравнения интенсивностей сигнала между спектрами STD и внерезонансного спектра. Чтобы рассчитать относительный STD в процентах, присвойте значение 100% протону, проявляющему максимальную интенсивность STD. Протонный спектр ЯМР STD для взаимодействия N-ацетиллактозы амина с человеческим галектином 7 показал сигналы ЯМР STD, указывающие на связывание.
Кроме того, были обнаружены сигналы, принадлежащие протонам в тесном контакте с белком, что позволило очертить связывающий эпитоп.
