Приготовление кондиционированной среды менингеальными клетками человека (ММК) и сбор спинномозговой жидкости для культивирования циркулирующих опухолевых клеток

Для начала покройте колбу T175 поли-L-лизином. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Теперь используйте стерильную серологическую пипетку для аспирации раствора лизина.

Пипетка объемом 30 мл в колбу полностью заправляется питательной средой менингеального слоя человека, содержащей менингеальные клетки человека. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия при добавлении 5% углекислого газа. Когда клетки достигают примерно 75–80% конфлюенции, соберите и сохраните культивируемую среду HMC в конической пробирке объемом 50 миллилитров.

Затем добавьте в пробирку полную менингеальную питательную среду в соотношении один к одному. Наконец, пипетируйте факторы роста в пробирку для создания кондиционированной среды HMC. Чтобы обработать спинномозговую жидкость, сначала поместите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров на льду, чтобы охладить.

Центрифугируйте жидкость в предварительно охлажденной центрифуге при температуре 257 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Пипеткой выйдите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу, и сделайте из нее аликвоты в разных пробирках. Теперь добавьте один миллилитр PBS в клеточную гранулу, чтобы сусуспендировать ее.

Центрифугируйте клетки при 1500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте надосадочную жидкость PBS, оставляя около 50 микролитров ее на дне трубки. Выполните подсчет клеток с помощью клеточной суспензии перед культивированием клеток.

Несколько факторов роста были повышены в средах, культивируемых с менингеальными клетками человека.