Подготовка криоконсервированных клеток RSC96 к наносекундной импульсной стимуляции электрическим полем

Для начала поместите криофлакон, содержащий один миллилитр клеточной суспензии RSC96, в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия, быстро встряхивая его. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку, содержащую от четырех до шести миллилитров готовой питательной среды, и хорошо перемешайте. Центрифугируйте пробирку при 1000 г в течение трех-пяти минут, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах полной питательной среды.

Теперь добавьте клеточную суспензию в колбу для культур, содержащую 628 миллилитров полной питательной среды, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Как только плотность клеток достигнет 80-90%, выбросьте питательную среду и промойте клетки один-два раза PBS без ионов кальция и магния. Затем добавьте в колбу с культурой 0,25% трипсина, 0,53 миллимоляра ЭДТА.

По окончании инкубации понаблюдайте за отслоением клеток под микроскопом. Как только большинство ячеек быстро станут круглыми и отсоединенными, верните колбу в рабочую зону и слегка постучите по ней. Добавьте три-четыре миллилитра питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.

Затем тщательно перемешайте содержимое колбы и отсадите раствор. Центрифугируйте клеточную суспензию. Добавьте 1 000G на пять минут.

После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в одном-двух миллилитрах свежей питательной среды с помощью щадящего пипетирования. Перенесите суспензию ячеек в новую колбу Т25. Добавьте соотношение один к двум и добавьте семь миллилитров питательной среды.