Для начала импортируйте все файлы факсов на панель анализа. Откройте один из файлов, чтобы просмотреть диаграмму рассеяния на стороне прямого рассеивания. Постройте многоугольные ворота, чтобы изолировать неповрежденные клетки, избегая мусора в левом нижнем углу участка.
Пометьте субпопуляцию как интактные клетки и перетащите эти ворота на панель всех образцов. Проверьте стробирование для каждого образца с помощью кнопки следующего образца. Дважды щелкните по субпопуляции интактных клеток отрицательного контрольного образца, чтобы открыть новый график.
Настройте ось графика в положение FL1-H по оси X, чтобы представить GFP, и FL2-H по оси Y, представляющей mCherry. Затем выберите инструмент для четырехугольного стробирования и нажмите на верхний правый край отрицательной популяции клеток. Перетащите четыре прямоугольных ворота на полосу неповрежденных ячеек.
Изучите каждый образец одноцветных элементов управления GFP или mCherry для правильного стробирования с помощью кнопки следующего образца. Перейдите в редактор макетов. Здесь выберите репрезентативные графики и выберите Копировать в редактор компоновок.
Выберите все репрезентативные графики, затем дважды щелкните, чтобы открыть определение графика. Назовите метку оси X как GFP, а метку оси Y как mCherry. Определите относительную эффективность репарации ДНК путем сравнения количества GFP-положительных клеток с количеством mCherry положительных клеток на том же участке.
Для обеспечения точности анализа NHEJ и HR была реализована подходящая стратегия корректировки компенсаций и стробирования. В соответствии с этой стратегией GFP-положительные клетки располагались в нижнем правом квадранте, а mCherry положительные клетки — в верхнем левом квадранте. Процент GFP-положительных клеток указывал на эффективность репарации ДНК DSB и трансфекции.
И наоборот, процент mCherry положительных клеток отражал только эффективность трансфекции. Эффективность репарации DSB ДНК рассчитывали как отношение GFP-положительных и mCherry-положительных клеток. Кроме того, роль белка синдрома Вискотта-Олдрича и белка SCAR Humalog или белка WASH в репарации ДНК была продемонстрирована с помощью анализа NHEJ на клетках shCONTROL и shWASH.
Потеря WASH снизила эффективность NHEJ, подчеркнув ее роль в продвижении NHEJ.
