Чтобы провести параллельные двухступенчатые реакции в пробирке модульной сборки на основе CRISPR или CRISPRmass, приступайте к расщеплению идентичных векторных остов плазмид кДНК/ORF с помощью sgRNA Cas9 на первом этапе реакции в пробирке. Для этого расположите правильно маркированные 0,2 миллилитровые трубки в алюминиевом охлаждающем блоке на льду. Приготовьте мастер-смесь для N числа реакций, смешав соответствующие количества Cas9, sgRNA, буфера Cas9 и воды, обработанной DEPC.
После того, как компоненты мастер-микса сложены вместе, сделайте их вихревыми, чтобы обеспечить правильное смешивание. Затем раскрутите смесь и добавьте по два микролитра мастер-смеси в каждую тюбик объемом 0,2 миллилитра. Затем добавьте в каждую пробирку 0,4 микролитра 0,019 микромолярной кДНК/ORF плазмиды.
Инкубируйте реакции расщепления при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. В следующей реакции в пробирке, на втором этапе, приступают к вставке векторно-специфичного модуля UAS в полученные линеаризованные кДНК/ORF плазмиды Cas9. Чтобы настроить одноступенчатую реакцию объемом 1,4 микролитра для каждого образца, расположите маркированные пробирки объемом 0,2 миллилитра в алюминиевом охлаждающем блоке на льду.
Подготовьте мастер-микс для N реакций, смешав соответствующие количества модуля UAS и мастер-микс для одноступенчатой реакционной сборки. Хорошо перемешайте смесь перед тем, как вращать ее. Затем нанесите по 0,77 микролитра мастер-смеси на каждую трубку.
Добавьте 0,7 микролитра линеаризованной кДНК/ORF плазмиды Cas9 в аликвоту в каждой пробирке и инкубируйте реакции при 50 градусах Цельсия в течение одного часа.