Крупномасштабное конструирование плазмид UAS-кДНК/ORF с помощью модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass)

Обратите внимание на то, что все переводы сгенерированы ИИ. Нажмите здесь для версии на английском языке.

80 Views

•

02:25 min

•

May 17th, 2024

DOI :

10.3791/201691-v

May 17th, 2024

•

Si Xu*¹^,², Mengyu Chen*¹^,², Guang Chen¹^,³, Si Luo⁴, Wen Xue¹^,², Xuelian Liu¹^,², Jiwu Wang¹^,²^,³, Ping Wei⁴

¹Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ²Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* Эти авторы внесли равный вклад

Транскрипт

Чтобы провести параллельные двухступенчатые реакции в пробирке модульной сборки на основе CRISPR или CRISPRmass, приступайте к расщеплению идентичных векторных остов плазмид кДНК/ORF с помощью sgRNA Cas9 на первом этапе реакции в пробирке. Для этого расположите правильно маркированные 0,2 миллилитровые трубки в алюминиевом охлаждающем блоке на льду. Приготовьте мастер-смесь для N числа реакций, смешав соответствующие количества Cas9, sgRNA, буфера Cas9 и воды, обработанной DEPC.

После того, как компоненты мастер-микса сложены вместе, сделайте их вихревыми, чтобы обеспечить правильное смешивание. Затем раскрутите смесь и добавьте по два микролитра мастер-смеси в каждую тюбик объемом 0,2 миллилитра. Затем добавьте в каждую пробирку 0,4 микролитра 0,019 микромолярной кДНК/ORF плазмиды.

Инкубируйте реакции расщепления при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. В следующей реакции в пробирке, на втором этапе, приступают к вставке векторно-специфичного модуля UAS в полученные линеаризованные кДНК/ORF плазмиды Cas9. Чтобы настроить одноступенчатую реакцию объемом 1,4 микролитра для каждого образца, расположите маркированные пробирки объемом 0,2 миллилитра в алюминиевом охлаждающем блоке на льду.

Подготовьте мастер-микс для N реакций, смешав соответствующие количества модуля UAS и мастер-микс для одноступенчатой реакционной сборки. Хорошо перемешайте смесь перед тем, как вращать ее. Затем нанесите по 0,77 микролитра мастер-смеси на каждую трубку.

Добавьте 0,7 микролитра линеаризованной кДНК/ORF плазмиды Cas9 в аликвоту в каждой пробирке и инкубируйте реакции при 50 градусах Цельсия в течение одного часа.

Смотреть дополнительные видео

Из серии

Построение высокопроизводительной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF с использованием CRISPRmass