Выделение ядер одиночных клеток из гомогенизированных образцов межмышечной жировой ткани человека для секвенирования РНК

После сбора гомогенизированной межмышечной жировой ткани человека в 1,7 миллилитровую пробирку с низким связыванием на льду, добавьте 14 микролитров 10% Triton X-100 в гомогенат. Инкубируйте пробирку в темноте на льду в течение 10–15 минут, выполняя ее каждые три минуты. В отдельной конической трубке объемом 15 миллилитров предварительно намочите один 100-метровый и один 40-микронный сетчатый фильтр со 100 микронными литрами DPBS.

Отфильтруйте гомогенат через сетчатое фильтр для клеток толщиной 100 микрон. Промойте пробирку объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием 400 микролитрами гомогенизационного буфера и отфильтруйте суспензию до 100-микронного клеточного фильтра. Далее полученную суспензию отфильтровать через 100-микронный фильтрат на 40-микронном сетчатом фильтре.

Равномерно распределите раствор по двум предварительно охлажденным пробиркам объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием. Центрифугируйте пробирки при температуре 2700G в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Выбросьте верхний липидный слой и надосадочную жидкость, оставив в первой пробирке примерно 50 микролитров.

Аккуратно пипеткой вверх и вниз 20 раз, не создавая пузырьков, чтобы повторно суспендировать гранулу в первой пробирке и перенести суспензию в новую пробирку объемом 1,7 миллилитра с низким связыванием. Затем добавьте 500 микролитров среды для выделения ядер в 1,7 миллилитра с низким связыванием и смешайте с пипеткой. Центрифугируйте пробирку при 1000G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 50 микролитров в пробирке, и осторожно пипеткой, чтобы повторно суспендировать гранулу. Затем добавьте 200 микролитров среды для выделения ядер, и перемешайте суспензию. Добавьте одну каплю раствора для окрашивания живых клеток и инкубируйте в темноте на льду.

Через 15 минут отфильтруйте раствор через сетчатое фильтр для ячеек толщиной 30 микрон. Смешайте раствор ядер и добавьте 10 микролитров в предметное стекло камеры для подсчета клеток. Подсчитайте ядра с помощью автоматического счетчика клеток.