Для начала необходимо получить дифференцированные клетки ТГП-1 и удалить отработанную среду из лунок культивального планшета После промывки клеток PBS добавьте в клетки бессывороточную среду, содержащую липополисахарид, или ЛПС, и инкубируйте планшет. Затем добавьте аденозинтрифосфат или стоковый раствор АТФ в модельную группу и инкубируйте планшет в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Далее отсасывайте всю надосадочную жидкость из лунок культуральной тарелки.
После двукратной промывки клеток PBS добавьте в каждую лунку по 500 микролитров 0,05%-ного трипсина без ЭДТА и инкубируйте в течение 30 секунд. Чтобы остановить отслоение клеток, добавьте один миллилитр среды RPMI 1640 и перенесите клетки в пятимиллилитровую пробирку. Центрифугируйте пробирку при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре.
После повторного суспендирования клеток в одном миллилитре PBS поместите пробирку с клетками на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на три минуты и центрифугируйте. Чтобы повторно суспендировать клетки, добавьте 100 микролитров связывающего буфера 1X и перенесите клетки в новую пятимиллилитровую пробирку. Инкубируйте контрольные и модельные пробирки с соответствующими реактивами в темноте при комнатной температуре.
Чтобы завершить инкубацию, добавьте в пробирку 400 микролитров PBS и аккуратно перебейте ее. Отфильтруйте клеточную суспензию в нейлоновую сетку размером 35 микрометров, закрепленную на пятимиллилитровой полистирольной трубке с круглым дном. Опустите чистое покровное стекло в раствор квасцов хрома на два часа и просушите его в духовке при температуре 37 градусов Цельсия.
Гранулируйте трипсинизированные клетки, как было показано ранее, и зафиксируйте клетки с помощью 500 микролитров фиксатора электронного микроскопа в течение двух часов при комнатной температуре, после чего последует ночная инкубация при четырех градусах Цельсия. Собрав клетки из фиксированного раствора, гранулируйте их при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров PBS и аккуратно продуйте клетки.
Опустите клеточную суспензию на покровное стекло и дайте ей постоять пять минут. Отсадите всю надосадочную жидкость и промойте клетки трижды с PBS по пять минут каждая. Добавьте 500 микролитров 1%-ного раствора фиксации осминовой кислоты.
Через час аспирируйте всю надосадочную жидкость. После трех промывок PBS обезвоживайте образцы с возрастающей концентрацией этанола. Включите сушилку для критических точек, откройте бак для углекислого газа и охладите камеру до 10 градусов Цельсия.
Быстро оберните образец фильтровальной бумагой и поместите его в камеру, когда давление в камере составит ноль фунтов на квадратный дюйм. Как только температура стабилизируется до 35 градусов по Цельсию и давление достигнет 1250 фунтов на квадратный дюйм, сбросьте давление со скоростью 100 фунтов на квадратный дюйм в минуту. Вынимайте пробу, когда давление в камере равно нулю.
Наконец, с помощью проводящей ленты закрепить образцы на сканирующе-электронном микроскопе, алюминиевых держателях образцов с помощью распылительного кодера. Покройте образцы слоем золота от двух до пяти нанометров. Анализ проточной цитометрии показал, что после стимуляции ЛПС/АТФ количество клеток в области QT значительно увеличилось, что указывает на гибель клеток.
Сканирование электронных микрофотографий поверхности плазматической мембраны показало характеристики пироптоза, включая блеббинг и разрыв мембраны в клетках, стимулированных ЛПС/АТФ, в то время как контрольные клетки выглядели нормально. Кроме того, стимуляция ЛПС/АТФ привела к появлению апоптотических характеристик в клетках, таких как блеббинг мембраны и усадка клеток, а также наблюдались клетки с характеристиками некроптоза, включая набухание клеток и разрыв мембраны.
