После сбора пучков гамет от гермафродитов и сперматозоидов от гонохорных видов кораллов, поместите их в помеченные 50-миллилитровые пробирки. Поместите четыре микролитра активированной суспензии сперматозоидов в счетную камеру Маклера. Чтобы оценить подвижность сперматозоидов, добавьте концентрацию активированного образца.
Откройте файл автоматического технического описания биобанка кораллов и введите коэффициент разбавления спермы, используемый для оценки с помощью компьютерного анализа спермы. Затем введите результаты компьютерного анализа спермы на концентрацию сперматозоидов, общую подвижность и прогрессирующую подвижность. Запишите концентрацию сперматозоидов на отфильтрованную пробирку с образцом спермы и перенесите пробирку на рабочую станцию криоконсервации.
Откройте автотаблицу общего биобанка кораллов и выберите вкладку «Криоконсервация». После проверки этикетки пробирки с образцом спермы определите соответствующую запись, проверив ID колонии.С помощью серологической пипетки измерьте объем образца спермы, взяв и вытолкнув его обратно в ту же пробирку. Введите значение в столбец E.Проверьте автоматически рассчитанный столбец 1 для требуемой концентрации криопротектора и столбец H для добавляемого объема криодилюента.
Запустите таймер. И с помощью пипетки по каплям добавить криодилюент ДМСО при постоянном бережном перемешивании образца. Запишите время выпуска криодилюента в колонку P.Прочтите колонку K, чтобы определить количество криопробирок для заполнения.
Откупорьте стерильные криопробирки со штрих-кодом и разложите крышки на стерильной поверхности. С помощью серологической пипетки и дозатора для аликвотирования разложите один миллилитр образцов в криопробирки со штрих-кодом и флаконы с крышками. Поместите один флакон с термопарой и все заполненные флаконы с образцами в пустой криоштатный вкладыш при комнатной температуре.
Затем поместите фиктивные криопробирки, содержащие 10% ДМСО, в фильтрованную морскую воду в пустые слоты на криостойке. Введите номер прогона в столбец U автоматического технического описания и отсканируйте серийный номер криоштатива в столбец V. Поместите курсор в нужную ячейку столбца Z и отсканируйте флакон с термопарой, а затем все криопробирки. Отложите загруженные и отсканированные стойки для остатка баланса криопротектора.
Заполните охлаждающую емкость криостойки жидким азотом до необходимого для охлаждения уровня примерно 20 градусов Цельсия в минуту. По истечении 10-минутного периода уравновешивания криопротектора подключите датчик термопары к регистратору данных и начните запись. Аккуратно поместите полную криорешетку в охлаждающую емкость и закройте крышкой.
Запишите время начала работы в столбце Q.Как только флакон термопары покажет 80 градусов Цельсия или ниже на регистраторе данных, перенесите вставку криостойки в ванну с жидким азотом для охлаждения образцов. Снимите криофлаконы со стеллажа и передайте их сухогрузчику для транспортировки в биобанк. У Acropora millepora предметные стекла камеры скольжения с фиксированной крышкой показали менее половины концентраций сперматозоидов по сравнению со счетной камерой Маклера.
Валидация счетной камеры Маклера с коммерчески доступными латексными микрогранулами в известной концентрации привела к стабильному подсчету с низкой вариабельностью в ожидаемом диапазоне. Не наблюдалось существенной разницы в концентрациях после размораживания общих, подвижных или прогрессивно подвижных сперматозоидов в образцах, криоконсервированных с использованием 20% или 30% ДМСО в качестве криодилуэта.
