Первичная диссоциация и пластинирование нейронов гиппокампа для измерения влияния патологических белков на аксональный транспорт

Начните с вскрытия гиппокампа из эмбрионального мозга мыши и поместите рассеченную ткань в ледяной буфер без кальция и магния или CMF. Затем снимите CMF и четыре раза промойте ткань свежим холодным CMF, аккуратно поворачивая трубку между полосканиями. Затем добавьте процеженный 0,125% раствор трипсина и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, перемешивая каждые пять минут.

После инкубации удалить раствор трипсина и два раза промыть ледяным CMF. Затем добавьте три миллилитра раствора для инактивации трипсина. Далее, чтобы диссоциировать клетки, титруйте 30 раз с помощью двухсекундных заборов иглой 14-го калибра, прикрепленной к трехмиллилитровому шприцу.

Продолжайте титрование двумя секундными втягиваниями 30 раз с помощью иглы 15 калибра, затем 20 раз с помощью иглы 16 калибра, а затем 20 раз с помощью иглы 18 калибра. Затем выполните трехсекундные заборы с помощью иглы 21 калибра 15 раз, чтобы завершить диссоциацию клеток. Проверьте наличие клеточных сгустков, поместив каплю клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа.

Далее отфильтруйте пять миллилитров FBS с помощью шприцевого фильтра 0,22 микрона. Аккуратно нанесите клеточную суспензию на FBS в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки при температуре 200 x g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Удалите FBS и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре теплой нейробазальной среды без антибиотиков. Разведите клеточную суспензию в 0,4% трипановом синем и получите количество клеток. Поместите клетки в 750 микролитров нейробазальной среды, не содержащей антибиотиков, в предварительно подогретую 4-луночную камеру, покрытую поли-D-лизином.

Инкубируйте клетки в камере с контролируемой влажностью при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.