Для начала соберите препарирующий микроскоп, два щипца с тонкими наконечниками, ножницы, иглу для шприца объемом в один миллилитр и фильтровальную бумагу на рабочей платформе. Затем с помощью локтевых ножниц заживите глаза мыши, находящейся под наркозом. Поместите глаза в стеклянную чашку, содержащую 4% параформальдегида и 0,2% пикриновой кислоты в 0,1 молярном фосфатном буфере.
На препарирующем микроскопе с помощью одномиллилитрового шприца проделайте отверстие в лимбе роговицы и отрежьте ножницами передний сегмент. С помощью щипцов снимите хрусталик с внутренней поверхности сетчатки. Теперь с помощью двух щипцов осторожно отслаивайте склеры до тех пор, пока сетчатка полностью не будет изолирована от наглазника.
Впоследствии разрежьте сетчатку на четыре части. После ночной фиксации и 4%-ного раствора параформальдегида промыть ткани сетчатки в 0,01 моляре PBS шесть раз по 10 минут. Инкубируйте ткань сетчатки в 1%-ном борогидриде натрия в 0,01 моляре PBS в течение 30 минут.
Снова промойте участки сетчатки в 0,01 моляра PBS не менее шести раз. Затем удалите стекловидное тело с помощью фильтровальной бумаги. И с помощью обоюдоострого лезвия бритвы разрежьте сетчатку на небольшие участки размером от 100 до 300 микрометров.
Промойте полоски сетчатки в 0,01 моляра PBS шесть раз по 10 минут каждый перед их инкубацией с Реагентом А и Реактивом Б из набора ABC в течение двух дней. Далее промойте полоски сетчатки в 0,05 молярном трис-буфере по 10 минут каждая. Предварительно инкубируйте полосы сетчатки с 5% реагентом 1 и 5% реагентом 3 из диаминобензола или набора DAB в дистиллированной воде в течение одного часа при комнатной температуре.
Чтобы окрашивать полоски сетчатки DAB, добавьте один и тот же объем раствора из трех тюбиков в наборе DAB по очереди. Под микроскопом вскрытия наблюдайте за состоянием окрашивания. Промойте полоски сетчатки 0,05 молярного трис-буфера три раза по 10 минут каждый.
Наконец, промойте полоски в 0,01 моляра PBS шесть раз по 10 минут каждый. В контрольных экспериментах ножки конуса с двумя лентами и стержневые сферические с одной лентой не показали иммунореактивности в отсутствие первичных антител. Протеинкиназа С-альфа идентифицировала палочковидные биполярные клетки в сетчатке.
Стенд DAB демонстрирует присутствие дендритов протеинкиназы Сальфа и биполярных клеток, образующих синапсы с палочками и конусами в наружном плексиформном слое. Кроме того, продукт реакции DAB помогает идентифицировать окончания биполярных клеток палочек и аксональные отростки во внутреннем плексиформном слое. Было показано, что амакриновые клетки иммунореактивности вещества P являются пресинаптическими по отношению к отрицательному амакриновому веществу Р.
Кроме того, амакриновые клетки иммунореактивности вещества P находились в постсинаптических и биполярных окончаниях на третьем и пятом уровнях внутреннего плексиформного слоя соответственно.
