Диссекция скелетной мускулатуры мыши после повреждения нотексином и процедура диссоциации клеток для анализа одиночных клеток

После усыпления мыши рассеките мышцы ТА и ГА с обеих задних конечностей и поместите их в крышку чашки Петри. С помощью ножниц разрежьте ткань на измельченную кашицу. Переложите измельченную салфетку в 50-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров ледяного буфера для диссоциации, и держите ее на льду.

После того, как пробирки с образцами нагреются до 37 градусов Цельсия, инкубируйте их в течение 45 минут при вращении в инкубаторе. Добавьте 10 миллилитров промывочной среды в пробирки с образцами и сделайте их вихревыми. Центрифугируйте пробирки, и отсасывайте содержимое до четырех миллилитров.

Далее добавьте по 0,5 миллилитров коллагеназы и распыляйте по клеткам. Затем сделайте вихрь и инкубируйте их. После инкубации переваренный образец центрифугирует и ресуспендирует гранулу пятимиллилитровой пипеткой.

Далее предварительно смочите 40-микронные ячеистые фильтры, размещенные на 50-миллилитровых пробирках, пятью миллилитрами промывочного материала. С помощью пятимиллилитрового шприца с иглой 20 калибра аспирируйте и извергайте клеточную суспензию 10 раз. Затем процедите клеточную суспензию через предварительно смоченный 40-микрометровый клеточный фильтр.

Собрав и процедив оставшиеся клетки с 10 миллилитрами промывочного средства, гранулируйте клеточную суспензию центрифугированием, отасуньте надосадочную жидкость из пробирки и осторожно взмахните гранулой, чтобы ослабить ее.