Начните с суспендирования митохондриальных фракций, полученных из клеточных культур или тканей млекопитающих, в синем буфере для нативных образцов для получения концентрации белка около 10 миллиграммов на миллилитр. Чтобы солюбилизировать митохондриальные мембраны, добавьте дигитонин для получения соотношения четыре грамма дигитонина на грамм митохондриального белка. Перемешайте с помощью аккуратного пипетирования и выдерживайте на льду в течение пяти минут.
Центрифугируйте суспензию в микрофуге при 20 000 G в течение 25 минут при четырех градусах Цельсия для удаления нерастворимого материала. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку, затем добавьте 5% Coomassie blue G-250, что эквивалентно одной трети первоначального объема ресуспендирования, и перемешайте с помощью пипетирования. Добавьте буфер холодного катода А в верхнюю камеру аппарата электрофореза и анодный буфер в нижнюю камеру.
Загрузите от 30 до 100 микрограммов митохондриального белка в лунки на полиакриламидном геле. После электрофореза поместите гель в пластиковую коробку. Добавьте достаточный объем соответствующего по активности гелю раствора для покрытия геля, и инкубируйте при комнатной температуре с легким встряхиванием, защищая от света.
Когда соответствующие полосы развились, удалите раствор для анализа. Дважды промойте гель дистиллированной водой, прежде чем закрепить его 40% метанолом и 10% уксусной кислотой в течение 30 минут. Анализ активности геля выявил различные паттерны сборки суперкомплекса в клетках мышей и человека.
Свободный комплекс 1 наблюдался в клетках мыши, в то время как в митохондриях человека он не обнаруживался. Паттерны Complex 4 были схожи в клеточных линиях человека, но варьировались в клеточных линиях мышей из-за мутантного варианта SCAF1.
