Оценка фагоцитарной функции макрофагов костного мозга новорожденных с помощью флуоресцентного анализа поглощения бактерий

Для начала ресуспендирования костного мозга новорожденных мышей производили макрофаги в полный DMEM без фенола красного или антибиотиков. Засейте 500 микролитров клеточной суспензии с плотностью 200 000 на квадрант в 35-миллиметровую четырехугольную чашку. Снимите заранее рассчитанный запас кишечной палочки от минус 80 градусов по Цельсию.

Аликвотируйте нужный объем клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра для приготовления бактериального посевного материала при кратности инфекции 25, затем добавьте PBS до общего объема в один миллилитр. Центрифугируйте бактериальную суспензию при 2000 G в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах PBS. Добавьте зеленый флуоресцентный pH-чувствительный краситель до конечной концентрации 500 микромоляров и инкубируйте в течение 20 минут в темноте для конъюгации красителя.

Промойте бактерии четыре раза одним миллилитром PBS центрифугированием при 1000 G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах полного DMEM без фенола красного и добавьте в костный мозг макрофагальные культуры. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение четырех часов.

Добавьте 200 нанограммов проницаемого для клеток красного флуоресцентного красителя для окрашивания лизосом, При бактериальной инфекции было обнаружено большое количество зеленых флуоресцентных бактерий, фагоцитированных внутри макрофагов, полученных из костного мозга. Зеленая флуоресценция далее локализуется красной флуоресценцией, указывающей на подкисленные лизосомы. Фагоцитоз и появление зеленых чувствительных к pH дипозитивных макрофагов костного мозга новорожденных также наблюдались на протяжении всей четырехчасовой инфекции.