После создания индуцированной перекисью водорода клеточной культуры MCF-7 выбросьте надосадочную жидкость из чашки для культивирования. Добавьте один миллилитр PBS и аккуратно встряхните блюдо, прежде чем выбросить PBS. Теперь добавьте один миллилитр трипсина, чтобы промыть клетки, встряхните посуду и подождите одну минуту, затем выбросьте трипсин.
Аккуратно постукивайте по чашке, наблюдайте за движением клеток в листе, чтобы подтвердить отслойку. Далее добавьте четыре миллилитра полной питательной среды и переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте суспензию при 800G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость.
Добавьте 200 микролитров PBS для ресуспензии гранулы и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 миллилитров. После этого выполняют повторные циклы замораживания-оттаивания для нарушения работы клеток. Центрифугируйте лизат клеток при 1500G в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость для анализа.
Разморозьте реагенты ИФА при комнатной температуре за 20 минут до начала анализа, предварительно нагрейте считыватель ИФА за 15 минут до использования. Разведите в рабочем растворе необходимый в 20 раз концентрированный промывочный буфер с деионизированной водой. Приготовьте рабочие растворы стандартных образцов и тщательно перемешайте их вверх и вниз без образования пузырьков.
В реакционные лунки добавить по 50 мкл стандартного рабочего раствора и детектирующих проб с разной концентрацией, исключая холостые лунки, в каждую реакционную лунку добавить по 100 мкл детектирующего антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена. Запечатайте лунки пластинчатой пломбой и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. После инкубации удалите раствор антител.
Стряхните остатки жидкости в лунках и промокните насухо на впитывающей бумаге. Добавьте по 350 микролитров промывочного буфера в каждую реакционную лунку. Через одну-две минуты выбросьте буфер, прежде чем добавлять по 50 микролитров субстратов А и В в каждую реакционную лунку.
Запечатайте пластину и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Через 15 минут добавьте по 50 микролитров стопового раствора в каждую реакционную лунку. Немедленно измерьте значение оптической плотности на длине волны 450 нанометров с помощью считывателя ELISA.
Влияние перекиси водорода на жизнеспособность клеток MCF-7 показало, что обработка 0,75 миллимоляра в течение 12 часов снижала жизнеспособность до 67%. При более высокой концентрации 1,5 миллимоляра жизнеспособность клеток резко упала до уровня ниже 3%. Клетки MCF-7 после увеличения концентрации перекиси водорода показали повышенные уровни 8-Oxo-dG, иллюстрируя влияние окислительного стресса на повреждение ДНК.
