Чтобы наблюдать за субклеточной локализацией GFP, после 48 часов агроинфильтрации Nicotiana benthamiana выберите плоский лист и сделайте шестимиллиметровое отверстие с помощью дырокола. Капните 30% раствор сахарозы на предметное стекло. Поместите образец листа обратной стороной вверх и накройте его покровным стеклом.
Соберите неповрежденные, свежие листья N.benthamiana, экспрессирующие рекомбинантный GFP, через три дня после агроинфильтрации и взвесьте листья. Промойте листовую пластинку предварительно охлажденной, стерилизованной водой двойной дистилляции для удаления мусора. Погрузите 20 грамм абаксиальной стороной вниз в 500 миллилитров предварительно охлажденного 100-миллимолярного фосфатного буфера в стакан с широким горлышком объемом 1000 миллилитров.
Накройте листья капроном толщиной 100 сетки, тонкой сетчатой пряжей и пластиковой тарелкой. Подключите стакан к вакуумному насосу. Подайте вакуум 0,8 мегапаскаль на одну минуту, затем быстро восстановите до атмосферного давления.
Извлеките листья из буфера и аккуратно промокните насухо впитывающей бумагой. Скатайте листья и оберните их сетчатой пряжей. Для сбора апопластичной промывочной жидкости, или AWF, поместите свернутые листья кончиком вверх в 50-миллилитровые центрифужные пробирки с сетчатой нитью, скрепленной крышками пробирок.
Центрифугируйте листья при 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите листья и соберите AWF с помощью пипетки. Добавьте смолу Nickel Sepharose excel в тюбик в соотношении один к 1, 000 относительно объема экстракта белка.
Промойте никелевую смолу три раза, по очереди по очереди в 10 раз больше объема смолы, чем в воде двойной дистилляции, и фосфатном буфере. Инкубируйте экстракт белка с никелевой смолой в течение двух часов, чтобы обеспечить полное связывание. Затем центрифугируйте при 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить несвязанные белки из надосадочной жидкости.
Промойте три раза с 20-кратным объемом смолы фосфатного буфера. После последней промывки добавьте в 10 раз больше объема смолы 250 миллимолярного имидазола, чтобы разбавить GFP. Центрифугируйте смесь при 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость.
Вестерн-блоттинг подтвердил переходную экспрессию 30 килодальтон рекомбинантного белка GFP в N.benthamiana. Флуоресцентная микроскопия показала наличие GFP в апопласте. Белки AWF, экстрагированные вакуумным инфильтрационным центрифугированием, также содержали GFP.
Из восьми протестированных растворов для экстракции фосфатный буфер экстрагировал наибольшее количество AWF и GFP. Сравнение фосфатного буфера при различных pH показало улучшенную экстракцию AWF и GFP при нейтральных и слабощелочных условиях. Кроме того, 100 миллимолярный фосфатный буфер показал максимальную эффективность для восстановления AWF и GFP.
С помощью 100-миллимолярного фосфатного буфера из апопласта было извлечено 495 микрограммов общих белков AWF на грамм свежего листа. Экстрагированный AWF содержал 10 мкг GFP, что соответствовало примерно 18% GFP в общем объеме растворимого белка. После аффинной хроматографии с никелем чистота GFP достигла 84,3% от экстракции AWF, что значительно выше, чем чистота 44,9%, достигнутая при экстракции общего растворимого белка.
