Оценка целостности эпителиального барьера двумерных монослоев, полученных из органоидов, с помощью анализа парацеллюлярной проницаемости

Для начала достаньте из инкубатора планшет, содержащий вкладыши для клеточных культур с 2D-монослоями, полученными из органоидов. Удалите монослойные питательные среды как из апикальной, так и из базолатеральной камер вставок для клеточных культур, подлежащих оценке. Аккуратно промойте апикальную и базальную камеры два раза 200 и 500 микролитрами предварительно подогретого PBS.

Извлеките промывочный раствор из апикальной камеры и нанесите 200 микролитров 0,5 миллиграмма на миллилитр четырехкилодальтонного индикатора FITC-декстрана в PBS в апикальную камеру вставки для клеточной культуры. Инкубируйте планшет во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 20 минут. Затем отбирают 50 микролитров из базолатеральной камеры инкубируемого 24-луночного планшета и переносят его на 96-луночный планшет, совместимый со считывателем микропланшетов.

Замените 50 микролитров свежего PBS в базолатеральной камере отбираемой лунки. С помощью предварительно откалиброванного считывателя микропланшетов немедленно измерьте интенсивность флуоресценции на длине волны возбуждения 495 нанометров и длине волны излучения 535 нанометров.