Начните с диссоциации ткани. С помощью двух пар щипцов удалите жировую ткань из тканей молочной железы. Следите за тем, чтобы оставшаяся ткань молочной железы весила примерно один грамм.
Промойте ткани молочной железы в пяти миллилитрах 75%-ного раствора этанола в течение пяти секунд. Затем умывайтесь 20 миллилитрами моющего раствора два раза по пять минут каждый. Затем с помощью двух хирургических лезвий разрежьте ткань молочной железы на более мелкие фрагменты.
Непрерывно в течение 15 минут для получения гомогената ткани переложите измельченную ткань в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 10 миллилитров раствора диспазы и коллагеназы, три миллилитра 0,25% трипсина и семь миллилитров PBS, чтобы получить в общей сложности 20 миллилитров раствора для пищеварения. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и выдерживайте в течение 1 1/2 часа, встряхивая трубку каждые 20 минут.
Чтобы остановить процесс пищеварения, добавьте 20 миллилитров нейтрализующего раствора. Затем пипетируйте содержимое пипеткой примерно 15 раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Отфильтруйте смесь через сетчатый фильтр 100 микрон.
После этого центрифугируйте при 156G в течение пяти минут. Затем удалите надосадочную жидкость. Повторите инкубацию гранулы с 20 миллилитрами нейтрализующего раствора, затем перемешайте с помощью пипетирования.
Снова центрифугируйте в течение пяти минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 10 миллилитрами исходной питательной среды. Поместите клеточную суспензию в 100-миллиметровую чашку для клеточных культур.
Культивируйте клетки в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. Заменяйте исходную питательную среду свежей средой для эпителиальных клеток каждые три дня. Проверяйте клетки и обновляйте среду каждые два дня.
С помощью этого протокола эпителиальные клетки молочной железы человека были выделены из ткани молочной железы. Анализ после изоляции показал, что клетки, обработанные ингибитором ROCK Y-27632, продемонстрировали выраженный рост по сравнению с контрольной группой. Анализ CCK-8 показал, что клетки в среде, содержащей Y-27632, пролиферировали со значительно большей скоростью, чем клетки в контрольной среде.
Иммунофлуоресцентные анализы подтвердили, что большинство клеток экспрессируют маркеры эпителиальных клеток молочной железы, CK7 и GATA3, с незначительным присутствием других типов клеток в последующих пассажах. Кроме того, исследования qRT-PCR показали стабильные уровни экспрессии CK7 и GATA3 в течение нескольких пассажей, что указывает на постоянный фенотип или способность к дифференцировке.
