Для начала приготовьте соответствующий раствор покрытия в модифицированном буфере Тироде и покройте восьмилуночный микропредметный стекольку, инкубируя его в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Затем дважды промойте покрытую микрогорку модифицированным буфером Tyrode's. Инкубируйте микропредметное стекло в модифицированном буфере Тайрода, содержащем пять миллиграммов на миллилитр BSA, в течение не менее 30 минут, чтобы погасить неспецифическую адгезию.
Для приготовления промытых тромбоцитов центрифужируют цитратной антикоагулянтной цельной кровью в дозе 200 G в течение 20 минут с получением обогащенной тромбоцитами плазмы. Затем добавьте индометацин и PGE1 в обогащенную тромбоцитами плазму и центрифугируйте при 500 G в течение 10 минут. Ресуспендируйте полученную тромбоцитарную гранулу в модифицированном буфере Tyrode's HEPES при температуре 37 градусов Цельсия для достижения плотности в четыре раза по 10 в степени семи тромбоцитов на миллилитр.
Дайте изолированным тромбоцитам отдохнуть в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте раствор DHE в суспензию тромбоцитов для достижения конечной концентрации 10 микромоляров и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. После инкубации извлеките блокирующий раствор из микропредметного стекла и расположите его на предметном столике микроскопа для визуализации.
Затем аккуратно дозируйте тромбоциты. Используйте 40-кратную масляную иммерсионную линзу на инвертированном конфокальном микроскопе для контроля преобразования DHE в 2-гидроксиетидий. Изображение в течение 10 минут, сбор изображений каждые 10 секунд.
Чтобы контролировать образование супероксид-анионов в ответ на агонист, добавьте растворимый агонист через 10 минут после дозирования тромбоцитов и собирайте флуоресцентные изображения в течение дополнительных 10 минут. С помощью этого протокола изучали генерацию супероксидных радикалов при адгезии тромбоцитов к коллагену или фибриногену, а также из тромбоцитов, адгезивных к ФАПЧ, стимулированных тромбином.
