Выделение мононуклеарных клеток из цельной крови для получения индуцированных микроглиеподобных клеток для исследования мозга

Для начала поместите 15 миллилитров градиентной среды в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и вращайте ее при температуре 1000 G в течение одной минуты при температуре 20 градусов Цельсия. Переверните пробирку с человеческой кровью, собранной в гепарине, и с помощью стерилизованного огнем пинцета снимите крышку с пробирки для сбора крови. Нанесите от 10 до 15 миллилитров крови в среду с градиентом плотности в пробирке.

Установите уровень замедления центрифуги на единицу и центрифугируйте пробирку с кровью при 1000 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Снимите верхний слой плазмы на расстоянии до одного сантиметра выше охристого слоя. Сцедите оставшуюся надосадочную жидкость из центрифужной пробирки в другую центрифужную пробирку, содержащую 10 миллилитров PBS.

Сбросьте уровень замедления центрифуги до трех и центрифугируйте пробирку с PBS и надосадочной жидкостью. Аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно постучите по трубке, чтобы ослабить гранулу. Затем добавьте 13 миллилитров изоляционной среды в пробирку центрифуги и промойте внутреннюю стенку, чтобы правильно собрать клетки.

С помощью стерилизованного огнем пинцета поместите 100-микрометровый клеточный фильтр на 15-миллилитровую коническую трубку. Затем отфильтровать клеточную суспензию через клеточный фильтр в 15-миллилитровую коническую трубку. Дозируйте равное количество клеточной суспензии в две 15-миллилитровые конические пробирки.

Перечислите ячейки, чтобы рассчитать подходящую концентрацию изоляционного буфера. Гранулируйте клетки при 250 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости добавьте соответствующее количество изоляционного буфера и пипетку около 20 раз, чтобы ослабить гранулу.