Для начала поместите экспериментальную мышь-самку на рабочую платформу. Внутрибрюшинно ввести 7,5 международных единиц гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы около 20:00 в первый день. Через 48 часов внутрибрюшинно ввести 7,5 международных единиц хорионического гонадотропина человека.
Разделите крышку чашки для клеточных культур на верхнюю и нижнюю половины. В верхнюю половину поместите четыре-шесть капель по пять микролитров ПВП каждая для размещения сперматозоидов. Добавьте от 8 до 10 капель по пять микролитров М2 в нижней половине каждой для процедуры ИКСИ.
Покройте средние капли ПВП и М2 примерно тремя миллилитрами минерального масла. Выделив хвост придатка яичка у усыпленного самца мыши, аккуратно промокните его на стерилизованной марле. Разрежьте придаток яичка хвоста и осторожно сожмите, используя щипцы для выпуска сперматозоидов, собирая их в предварительно уравновешенные трубчатые пробирки с жидкостью человека.
Промойте придаток яичек хвоста в предварительно подогретой среде для трубной жидкости человека. Поместите пробирку без крышки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в инкубатор для емкости сперматозоидов. На четвертый день после инъекции хорионического гонадотропина человека поместите усыпленную самку мыши под препарирующий микроскоп.
С помощью иглы 25-го калибра разорвите ампулу яйцевода, чтобы высвободить многочисленные кучевые комплексы ооцитов. После емкости произведите ультразвуковую обработку 100 микролитров сперматозоидов в течение пяти секунд, чтобы отделить головки от хвостов. Заполните иглу для микроманипуляций рабочей жидкостью, следя за тем, чтобы заполненная часть находилась на расстоянии 0,5 сантиметра внутри иглы.
Установите иглу на правый рычаг микроманипулятора и закрепите его, затянув удерживающий колпачок. Затем установите пипетку для микроманипуляций с плоским наконечником на левую руку микроманипулятора. Расположите иглу для инъекции и пипетку в поле зрения микроскопа.
Под поляризационным микроскопом определите положение метафазного веретена внутри ооцита, чтобы убедиться, что веретенообразный аппарат не находится на стороне инъекции. При контакте инъекционной иглы с zona pellucida активируйте пьезоимпульсы с интенсивностью пять и частотой один, создавая перфорацию в zona pellucida и позволяя игле для инъекций пройти через нее. Используя пьезоимпульсы интенсивностью 1 и частотой 1, создают небольшую пору в плазматической мембране, обеспечивая введение головки сперматозоида в ооплазму.
С помощью атравматичных щипцов тщательно обработайте яичники, яйцеводы и матку от обезболенной псевдобеременной самки мыши. Сделайте небольшой надрез под углом вверх с помощью кончика иглы шприца на стенке матки ниже маточно-трубочного соединения, избегая попадания кровеносных сосудов. Аккуратно введите яйцевод на два-три миллиметра через маленькое отверстие.
При использовании метода ИКСИ уровень оплодотворения у мышей составил 89,57%, при этом 87,38% зигот перешли на стадию 2-клеточного эмбриона в течение 24 часов после ИКСИ. Рождаемость живых детенышей после переноса эмбрионов наблюдалась на уровне 42,5%Не было существенных колебаний случайных уровней глюкозы в крови между мышами, рожденными естественным путем, и мышами с ИКСИ. Тем не менее, самцы мышей с ИКСИ постоянно демонстрировали повышенный уровень глюкозы в крови натощак, что свидетельствует о нарушении гомеостаза глюкозы.
В тестах на толерантность к глюкозе были отмечены значительные различия в уровнях глюкозы в крови между самцами ИКСИ и контрольными мышами, в то время как у самок мышей разница не наблюдалась. При отслеживании массы тела как самцы, так и самки мышей ИКСИ демонстрировали фенотип избыточного веса по сравнению с контрольной группой.
