Получение заранее подготовленных желудочных органоидов человека для профилирования pH. Для начала подключите электрод сравнения к кабелю pH-электрода через разъем. Затем подключите микроэлектрод к усилителю, а усилитель — к заземленному ПК с программным обеспечением через USB-кабель.
Поместите микроэлектрод и электрод сравнения в деионизированную воду, чтобы погрузить оба кончика в жидкость не менее чем на один сантиметр. Заполните 50-миллилитровые конические пробирки нужными калибровочными буферами. С помощью деликатной лабораторной салфетки аккуратно промокните защитную трубку вместе с электродом сравнения.
После открытия программного обеспечения на вкладке калибровки выберите поле Y-Zoom, а затем установите показания сигнала датчика на милливольты. Начиная с электродов в буфере pH 4,01, введите 4,01 в качестве известного значения pH. Выберите «Добавить точку», когда показания милливольта стабилизируются, затем поместите оба электрода обратно в деионизированную воду для их промывки.
Повторив процесс для буфера pH 9,21, нажмите кнопку «Добавить точку», когда сигнал стабилизируется на уровне около 83 милливольт. Убедитесь, что микроэлектроды линейно реагируют в диапазоне от pH 4,01 до 9,21 для двухточечной калибровочной кривой. Осторожно положите защитный чехол на скамью и быстрым движением снимите его, чтобы снять микроэлектрод.
Установите микроэлектрод на микроманипулятор и расположите стереоскоп и микроманипулятор таким образом, чтобы микроэлектрод мог свободно продвигаться к чашке с культурой. Расположите чашку для культивирования, содержащую органоиды, для профилирования. Слегка закрепите электрод сравнения на зажиме на кольцевой подставке слева от стереоскопа.
Визуально продвигайте кончик микроэлектрода до тех пор, пока он не будет достаточно погружен в среду. Как только сигнал стабилизируется, запишите три показания pH среды. Затем медленно продвигайте микроэлектрод в ВКМ, не касаясь органоидов.
Запишите не менее трех показаний pH, чтобы рассчитать среднее значение. Расположите микроэлектрод вдоль перпендикулярной оси к поверхности органоида, аккуратно делая небольшое углубление на базолатеральной поверхности органоида, не проникая в нее. Осторожно введите микроэлектрод в органоид и измерьте рН просвета.
После завершения приступайте к измерению pH для следующего органоида. Поместите очищаемый электрод обратно в защитную трубку. Последовательно промойте электрод деионизированной водой, этанолом и буфером.
Поместите электрод сравнения в стакан, наполненный трехмолярным раствором хлорида калия. Заполните стеклянный капилляр объемом два микролитра стерильным минеральным маслом и загрузите его на нанолитровый автоинъектор, управляемый микроманипулятором. Наконец, заполните его раствором, содержащим 0,02% метилового красного и 150 миллимолярной соляной кислоты, и выполните инъекцию 9,2 нанолитра раствора.
Изменение рН люминала по 10 органоидам на одной и той же культуральной пластине было минимальным, с измерениями постоянно около 8,16. Внутрипросветный pH по пяти различным органоидным линиям был одинаковым в каждой культуре, но между органоидными линиями наблюдалась значительная вариабельность. Органоидный люминальный pH был последовательно ниже, чем у ВКМ, который, в свою очередь, был ниже, чем pH среды, что позволяет предположить, что люминальный pH физиологически актуален и не определяется исключительно окружающей средой культуры.
Инъекция метилового красного в просвет органоида подтвердила, что его pH превышает 6,2, что согласуется с измерениями микроэлектродов, которые показали почти нейтральный pH.
