Для начала получите культуру клеток PANC-1 и промойте клетки девятью миллилитрами сбалансированного раствора соли Хэнка с шагом в три миллилитра. Инкубируйте клетки с двумя миллилитрами трипсина в течение примерно 10 минут. Чтобы нейтрализовать суспензию, добавьте три миллилитра DMEM с добавлением 10% FBS.
После семикратного промывания клеток с шагом в один миллилитр среды соберите каждую нейтрализованную аликвоту в 15-миллилитровую пробирку. Аналогичным образом получают трипсинизированные звездчатые клетки поджелудочной железы человека, или HPaSteC, используя раствор для нейтрализации трипсина и среды звездчатых клеток. Смешайте необходимое количество обеих клеточных суспензий в 11 миллилитрах DMEM с 10% FBS во избежание образования пены.
Аккуратно внесите 100 микролитров клеточной суспензионной смеси в культуральную пластину и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На третий день добавьте 50 микролитров DMEM с 10% FBS в каждую лунку вдоль стенки лунки. На 10 или 11 день отсасывайте отработанные среды, не нарушая раствор возле ореола, и добавьте по 100 микролитров свежей среды вдоль бортика каждой лунки.
На 14 или 17 день с помощью пипетки объемом в один миллилитр удалите среду из каждой лунки до тех пор, пока не будет достигнут ореол. Выровняйте пластину по фону капюшона, чтобы расположить сфероиды внизу. Аккуратно нанесите пипеткой около 50 микролитров среды рядом со сфероидами, чтобы потревожить ее для скопления.
Было обнаружено, что сфероиды, полученные на 14-й день, выросли до среднего объема 0,048 кубических миллиметров.
