Очистка и анализ CD4⁺ Т-клеток наивных мышей с помощью негативного отбора на основе магнитных шариков

Для начала приготовьте мышиную селезеночную одноклеточную суспензию из расчета один умножить на 10 в размере восьми клеток на миллилитр в объеме от 0,1 до двух миллилитров. Добавьте в пробу 50 микролитров сыворотки от крыс. Переложите образец в пятимиллилитровую пробирку из полистирола с круглым дном.

Добавьте в пробу 50 микролитров изоляционного коктейля. Хорошо перемешайте и выдержите 7,5 минут при комнатной температуре. Теперь добавьте 50 микролитров на миллилитр обедненного коктейля.

Хорошо перемешать и выдерживать 2,5 минуты. Тем временем нанесите вихревые магнитные шарики, чтобы обеспечить равномерное рассеивание. Добавьте в образец 75 микролитров магнитных шариков.

Хорошо перемешать и выдерживать 2,5 минуты. Долейте образец со средним значением RPMI 1640 до конечного объема 2,5 миллилитра и перемешайте несколько раз. Затем поместите трубку в магнит на 2,5 минуты.

Возьмите в руки магнит и переверните его вместе с трубкой одним непрерывным движением, выливая обогащенную клеточную суспензию в новую пробирку. Определяют номер клеток с помощью гемоцитометра. Проведите проточный цитометрический анализ на наивные CD четыре положительные Т-клетки до и после выделения.

После литкования переложите клеточную суспензию в новую центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 400G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулу в дозе от 200 до 500 микролитров среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS.

На каждый один миллилитр клеточной культуры добавьте два микролитра коктейля для активации лейкоцитов и перемешайте. Культивируйте клетки в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия с насыщенной влажностью в течение четырех-шести часов.