Забор субэндотелиального матрикса из культур микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки (REC) для измерения жесткости с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ)

Для начала промойте покрытые покрытием из глутаральдегида сшитыми желатином стекла в PBS, содержащем кальций и магний, около пяти раз на орбитальном шейкере. Во время первых трех полосканий поднимите покровные стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить тщательное смывание глутарового альдегида. Далее замените питательную среду мышиных RECs свежей средой с добавлением стерильной, отфильтрованной аскорбиновой кислоты.

После 15 дней лечения промойте клетки PBS без кальция и магния. Инкубируйте клетки в 250 микролитрах теплого буфера для децеллюляризации в течение двух-трех минут. Подтвердите децеллюляризацию клеток под фазово-контрастным микроскопом.

Аккуратно выведите пипетку из буфера, не нарушая секретируемый REC субэндотелиальный матрикс. Затем добавьте в каждую лунку по 0,5 миллилитра PBS. После удаления PBS добавьте 200 микролитров ДНКазы без РНКазы.

Инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы удалить весь клеточный мусор. Далее просмотрите макромасштабный фиброзный субэндотелиальный матрикс под фазово-контрастным микроскопом. Затем используйте конфокальный микроскоп для просмотра более тонких наноразмерных матричных волокон при 100-кратном увеличении.

Агрегаты субэндотелиального матрикса наблюдались на стеклах после децеллюляризации 10-дневных или 15-дневных культур REC человека или мыши. Конфокальная микроскопия децеллюляризованных матриц показала плотный нанофибриллярный коллаген-IV и фибронектиновую матрицу.