Для начала необходимо получить клетки лейкемии, выращенные в оптимальных условиях для трансплантации. Подсчитав клетки, гранулируйте их по 300г в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Для окрашивания CM-Dil повторно суспендируют клетки в рабочем растворе до получения однократно 10 в степени шести клеток на 100 микролитров и инкубируют их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.
Промойте клетки два раза 10 миллилитрами 1X HBSS комнатной температуры. После гранулирования клеток по 300 г в течение пяти минут повторно суспендируйте их в PBS, содержащем 1% FBS, чтобы достичь плотности 40 000 клеток на микролитр. Затем включите микроинжектор и насос.
Установите давление впрыска от 9 до 11 фунтов на квадратный дюйм, а время инъекции - 0,5 секунды для зажима иглы и установки отверстия. Загрузите около пяти микролитров суспензии опухолевых клеток в микроиглу осторожно, за один проход, избегая образования пузырьков воздуха. С помощью щипцов Dumont 5 разрежьте конец иглы, чтобы получить отверстие, которое сможет выдержать выброс.
Затем отбирают здоровые эмбрионы рыбок данио под микроскопом, отсеивая любые с аномалиями развития. С помощью стеклянной пастеровской пипетки возьмите обезболенные эмбрионы и расположите от 10 до 15 из них в боковом положении на 1,5%-ной агарозной пластине. Удалите лишнюю воду, чтобы оставить минимальное количество для выживания эмбриона.
Далее подтвердите под световым микроскопом, что игла хорошо надрезана и имеет ячейки. Введите от 10 до 15 нанолитров, что соответствует 400-600 клеткам, в желток эмбрионов на 0,2-0,3 секунды. После введения всех эмбрионов соберите их в свежей зародышевой воде.
Через час после инъекции контролируйте болюс клеток, чтобы отделить эмбрионы с оптимальным окрашиванием или хорошим болюсом от эмбрионов с более низким окрашиванием или нижним болюсом. Окрашивание CM-Dil и маркировка флуоресцентными белками позволили отслеживать прогрессирование заболевания с помощью микроскопии. А выживаемость эмбрионов снизилась после инъекции с двумя генетически разными линиями лейкемии.
