Для начала положите 3 раза по 10 в степень 6MCA205 клетки фибросаркомы в 10 миллилитров полной питательной среды в чашку Петри 100 миллиметров. Облучите клетки ультрафиолетовым светом и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение не менее шести часов, чтобы дать им умереть. Дважды промойте дифференцированные дендритные клетки (ДК) при 1100G в течение четырех минут в полной питательной среде.
Подсчитайте пустые ДК, полученные из костного мозга, с помощью теста на исключение синего красителя Trypan. Центрифугируйте облученные раковые клетки при температуре 1100G в течение пяти минут. Установите совместное культивирование пустых ДК с облученными апоптотическими ячейками в соотношении два к одному в 12-луночном планшете на 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
На следующий день промойте клетки дважды по 1100G в течение пяти минут по 10 миллилитров полной питательной среды в 15 миллилитровых пробирках. Для окрашивания поверхности клеток повторно суспендируйте ДК, полученные из костного мозга, в 20 микролитрах холодного буфера FACS и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. После промывания клеток буфером FACS добавьте 100 микролитров PBS, содержащего краситель ближнего инфракрасного диапазона, который можно поправить на жизненную силу, в течение 30 минут.
Промойте ячейки один раз с помощью PBS перед повторной суспензией в буфере FACS. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSCA и SSCA. Затем нанесите графики FSCA и FSCH, чтобы исключить дублеты и скопления ячеек из анализа.
Построение графика полосы пропускания излучения от 780 до 60 нанометров и SSCA для удаления мертвых клеток. Используя фильтры с полосой пропускания 575–26 и 530–30 нанометров, определите положительную способность клеток для маркера CD11C и флуоресцентного клеточного линкера PKH67 на двух графиках плотности параметров. После подсчета культивировали CD8 Т-клетки с ДК, полученными из костного мозга, которые поглощали апоптотические клетки MCA205 в соотношении 2-5:1 при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов.
Добавьте EdU в среду для совместного культивирования в концентрации 10 микромоляров и инкубируйте в течение 16-20 часов. Дважды центрифугируйте CD8 cross prime при температуре 1100G в течение пяти минут и окрашивайте поверхностные маркеры в холодном буфере FACS в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте. После двукратного промывания клеток в буфере FACS, повторно суспендируйте их в 100 микролитрах PBS, содержащем корректируемый жизненный силу, водный краситель на 30 минут.
Промойте клеточные суспензии один раз тремя миллилитрами 1% БСА в PBS в проточных трубках. Добавьте 100 микролитров 4%-ного параформальдегида на 15 минут для фиксации клеток. Инкубируйте клетки в 100 микролитрах пермеабилизации на основе сапонина и промойте реагентом в течение 15 минут.
Добавьте 500 микролитров реакционного коктейля и выдерживайте 30 минут в темноте. После промывки повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах пермеабилизации на основе сапонинов и промывочного реагента. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSEA и SSEA.
Затем построите графики FSEA и FSEH, чтобы исключить дублеты и скопления клеток из анализа. Построение графика полосы пропускания излучения от 525 до 50 нанометров и SSCA для удаления мертвых клеток. Используя графики плотности фильтра с полосой пропускания 530–30 и 575–26 нанометров, можно определить положительную способность клеток к CD8a и CD3.
Анализируйте ячейки для включения Alexa Fluor 647 EdU в гистограмму с одним параметром с помощью эмиссионного фильтра с полосовым пропусканием от 660 до 620 нанометров. CD11c положительные дендритные клетки эффективно поглощали апоптотические раковые клетки MCA205 при 37 градусах Цельсия, демонстрируя температурно-зависимый фагоцитоз на ранних стадиях цикла иммунитета рака. После фагоцитоза дендритные клетки показали повышенный уровень CD86 и MHC-II наряду со снижением уровня PDL1.
Клональная экспансия CD8-положительных Т-клеток после активации зрелыми дендритными клетками была очевидна со скоростью пролиферации около 20%. С помощью моделей «опухоль на чипе» наблюдалась хемотаксическая реакция этих Т-клеток на высвобождение раковыми клетками алармина.
