Для начала добавьте HUVECs в 10-миллилитровую пробирку Falcon, содержащую восемь миллилитров эндотелиальной питательной среды. Добавьте в пробирку два миллилитра стокового раствора METHOCEL и хорошо взболтайте. Далее переложите 25 микролитров смеси на перевернутую внутреннюю поверхность большой квадратной чашки Петри.
Аккуратно поверните крышку на 180 градусов, поместите ее на дно сосуда для клеточной культуры и инкубируйте в течение ночи. На следующий день добавьте 2,3 миллилитра коллагена из крысиного хвоста типа I во флакон, содержащий 0,28 миллилитра 10X Medium 199. Держите эту смесь на льду и перемешивайте, пока она не станет равномерно желтой.
Титруйте смесь против гидроксида натрия до тех пор, пока она не станет оранжевой. Затем добавьте 50 микролитров буфера HEPES в конечный продукт. Соберите подвешенные культивируемые клетки в 50-миллилитровую пробирку Falcon с 20 миллилитрами PBS, затем центрифугируйте.
После выброса надосадочной жидкости добавьте в сфероидную гранулу 0,1 миллилитра FBS и 0,4 миллилитра эндотелиальной базальной среды. Осторожно постучите по трубке, чтобы снова суспензировать гранулу. Теперь пипеткой налейте два миллилитра стокового раствора METHOCEL и хорошо перемешайте.
Затем добавьте два миллилитра приготовленной коллагеновой смеси к ресуспензионным сфероидам. Дозируйте 0,5 миллилитра полученной смеси в лунки 24-луночной пластины и инкубируйте. Далее пипеткой в лунки планшета впрыскиваем 100 микролитров разведенного рекомбинантного фактора роста эндотелия сосудов человека.
Инкубируйте клеточную культуру при температуре 37 градусов Цельсия с добавлением 5% углекислого газа в течение 12 часов. На следующий день с помощью инвертированного микроскопа сделайте снимки сфероидов, которые не соприкасаются с краем лунки, друг с другом или имеют признаки повреждения. Сфероиды, стимулированные только базальной средой или рекомбинантным фактором роста эндотелия сосудов человека, были четко различимы.
Сфероиды в некачественных гелях по-видимому падали на землю и рассеивались. Отрицательный контроль показал умеренную исходную скорость прорастания, в то время как фактор роста эндотелия сосудов человека удвоил или утроил относительную длину прорастания. Количество ростков показало схожий динамический диапазон.
