Внутрикамерное введение препарата Хёхст для оценки биодоступности красителя к клеточному слою эндотелия роговицы

Для начала загрузите пять микролитров раствора Хёхста в стерильный стеклянный шприц Hamilton объемом 10 микролитров, прикрепленный к тупой игле 34 калибра. Введите эту иглу шприца в переднюю камеру через самогерметизирующийся роговичный туннель и введите раствор. Удерживайте иглу на месте в течение двух-трех секунд, пока вся жидкость не исчезнет.

Медленно вытяните иглу, чтобы извлечь ее, не допуская протекания. Затем проведите энуклеацию обоих глаз. Чтобы изолировать роговицу, разрежьте склеру вокруг зрительного нерва и сделайте четыре дополнительных разреза от зрительного нерва к роговице.

Слейте лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги ватман. Разложите срезанную склеру, и отделите сетчатку от склеры. Вытащите и выбросьте хрусталик и сетчатку глаза.

Далее удалите радужную оболочку. Разрежьте и выбросьте склеры вокруг роговицы. И осторожно поднимите роговицу вверх.

Поместив роговицы на предметное стекло, окрасьте их 0,5% Ализарина Красного для идентификации эндотелиальных клеток. После удаления излишков пятна трижды промойте роговицу, и наложите на нее чехол. Исследуйте роговицу под световым микроскопом, чтобы получить изображение окрашивания эндотелиальных клеток красным ализарином.

Кроме того, оцените роговицу под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать за окрашиванием Хёхста, и сравните его с неинъецированной роговицей в качестве контроля. Краситель Хёхста, ДНК-связывающий клеточный проницаемый флуоресцентный маркер, был использован для оценки биодоступности препарата посредством внутрикамерного введения. Поглощение эндотелиальными клетками роговицы методом флуоресцентной микроскопии исследовали через 15 минут после инъекции.

Окрашивание Ализарином красным выделило межклеточные границы эндотелиального слоя. Кроме того, положительное окрашивание по методу Хёхста в ядрах эндотелиальных клеток роговицы подтвердило успешную доставку красителя с помощью этого метода.