Для начала приготовьте раствор покрытия, содержащий матрицу базальной мембраны с уменьшенным фактором роста и органоидную питательную среду в соотношении один к двум. Добавьте 115 микролитров раствора покрытия в каждую лунку 48-луночного планшета и поместите планшет при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут в увлажненный инкубатор. Для коллагенового метода добавьте один миллилитр коллагенового геля в 30-миллиметровую внутреннюю мембранную вставку и дайте ему затвердеть в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе.
Для сбора клеточной смеси промойте только что резецированную ткань меланомы в 10-миллилитровой чашке Петри, содержащей моющее средство, которое помещается на лед. С помощью стерильного пинцета перенесите опухоль во вторую посуду с моющим средством для следующего промывания льдом. На протяжении трех циклов полоскания с помощью стерильных ножниц и лезвия удалите излишки соединительной ткани, жира и остаточной крови.
Поместите опухоль в пустую чашку Петри и мелко измельчите ее стерильными лезвиями. Затем переложите измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров приготовленной среды для варки. Поместите конус на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и делайте вихрь каждые пять минут.
Через 25 минут добавьте 30 миллилитров среды ADMEM/F12, содержащей 10% FBS, чтобы остановить пищеварение. Затем отфильтруйте расщепленную клеточную суспензию через нейлоновое сетчатое фильтр 70 микрометров и промойте его добавкой ADMEM/F12. С помощью пипетки извлеките остатки среды в нижней части фильтра.
Затем гранулируйте клетки при 300 х г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в органоидной питательной среде. Для культивирования засейте 200 000 клеток в довоенные лунки, покрытые матригелями, с добавлением 200 микролитров органоидной питательной среды.
В качестве альтернативы засейте 1 миллион клеток, смешанных с одним миллилитром коллагенового геля на предварительно затвердевшей мембранной вставке из коллагенового геля, помещенной в шестилуночный планшет, и добавьте в лунку органоидную питательную среду. Для прохождения органоидов размером от 150 до 200 микрометров переведите их в коническую форму объемом 15 миллилитров и промойте с помощью PBS Dulbecco. Центрифугируйте смесь при 300 х г в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости инкубируйте органоиды с заменителем трипсина и перемешивайте каждые три минуты. Чтобы остановить пищеварение, добавьте ADMEM/F12 с восстановленной сывороточной средой, содержащей 10% FBS. Центрифугируйте смесь при 300 х г в течение семи минут и повторно суспендируйте нёбо в органоидной питательной среде.
Наконец, засейте суспензию одиночных клеток в новую матригелю или лунку, покрытую коллагеном, с той же начальной плотностью посева для инкубации. Микроскопические изображения органоидов в конце matrigel на второй и седьмой день показали, что размер органоидов постепенно увеличивался. Кроме того, не было статистически значимой разницы в соотношении альфа-бета-Т-клеток между родительскими опухолями и соответствующими органоидами, культивируемыми в матригеле или коллагене.
