Сборка и отжиг дуплексов нуклеиновых кислот для характеристики ферментативного процессинга ДНК модифицированными олигонуклеотидами

Для начала центрифугируйте лиофилизированную пробирку, содержащую олигонуклеотиды, на полной скорости в настольной центрифуге в течение двух-пяти минут. Ресуспендируйте олигонуклеотиды в буфере TE для получения основного запаса размером 100 микромоляров и аккуратно обведите пробирку вихрем. Разбавьте аликвоту исходного материала TE-буфером для получения 10-микромолярного сырья и приготовьте реакционную мастер-смесь.

После дозирования смеси по необходимым пробиркам отжигите олигонуклеотиды в термоамплификаторе при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Дайте трубке остыть до комнатной температуры от 30 минут до одного часа. Затем добавьте в мастер-смесь нуклеотидные кофакторы и другие термочувствительные буферные компоненты.

При необходимости храните смесь при температуре 20 градусов Цельсия для использования в будущем. Соедините 22,5 микролитра мастер-смеси субстрата с 2,5 микролитрами ДНК-лигазы в ПЦР-пробирке. Немедленно поместите реакционные пробирки в ПЦР-машину при температуре 25 градусов Цельсия на 30 минут.

Чтобы погасить реакцию, добавьте пять микролитров загружающего красителя и выдерживайте при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.