Для начала поместите трипсинизированную культуру клеток Sf1Ep и 6-луночный планшет на рабочую платформу. Добавьте соответствующее количество ячеек Sf1Ep и среды Sf1Ep в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение ночи.
Соедините компоненты TpCM-2 в стерильной емкости, добавив дитиотреитол в качестве сухого порошка в последнюю очередь. Аккуратно перемешайте и отфильтруйте стерилизующую среду с помощью фильтрующего блока 0,22 микрометра. Предварительно уравновесьте среду в анаэробной банке, опорожните камеру с помощью домашнего вакуума и трижды наполните смесью 95% азота и 5% углекислого газа.
Затем долейте 1,5% кислорода, 5% углекислого газа и сбалансируйте газообразную смесь азота. Быстро переложите среду в тригазовый инкубатор, установите его при температуре 34 градуса Цельсия и инкубируйте в течение ночи. После ночной инкубации удалите среду из культуры Sf1Ep и промойте клетки небольшим объемом предварительно уравновешенного TpCM-2.
После удаления ополаскивателя добавьте соответствующее количество TpCM-2 и уравновесьте пластину в 1,5% кислорода, 5% углекислого газа и сбалансируйте атмосферу азота при температуре 34 градуса Цельсия в течение трех-четырех часов. Извлеките существующую культуру T.pallidum из инкубатора с низким содержанием кислорода и исследуйте клеточный слой Sf1Ep в каждой лунке. После записи плотности и внешнего вида клеток пипетируйте среду из каждой лунки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Промойте каждую лунку 0,35 миллилитров предварительно подогретого трипсина-ЭДТА и добавьте ополаскиватель в 15-миллилитровую пробирку. Добавьте еще 0,35 миллилитра трипсина-ЭДТА в каждую лунку и инкубируйте в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия, чтобы удалить клетки Sf1Ep из планшета и T.pallidum из клеток Sf1Ep. После отделения диссоциированные клетки T.pallidum и Sf1Ep объединить с резервной средой, собранной в конической пробирке объемом 15 миллилитров, и записать общий извлеченный объем для расчета урожайности одной культуры.
В заранее подготовленную пластину с клетками Sf1Ep инокулируют заданным объемом собранного T.pallidum. После замены атмосферы в тарелке инкубируйте при температуре 34 градуса Цельсия в кувшине для пивоварения или в трехгазовом инкубаторе. После посева используйте камеру-помощник для подсчета T.pallidum под микроскопией в темном поле.
Добавьте 50% глицерина до конечной концентрации 10% в культуру T.pallidum и диспергируйте глицерин с помощью осторожного пипетирования или инверсии. Распределите препарат по одному-двум миллилитровым аликвотам по завинчивающимся флаконам морозильной камеры и сразу же поместите флаконы в морозильную камеру с температурой 80 градусов Цельсия или морозильную камеру с жидким азотом. Подготовьте и предварительно уравновесьте два 96-луночных планшета с 1000 клетками Sf1Ep и 200 микролитрами TpCM-2 на лунку и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур.
На следующий день замените среду Sf1Ep на TpCM-2, как описано ранее. После количественного определения разведите T.pallidum в TpCM-2 с получением двух препаратов с концентрациями 10 и 40 клеток на миллилитр. Инокулируйте 50 микролитров на лунку препарата 10 T.pallidum на миллилитр в одну из приготовленных 96 эллитровых пластин.
В две контрольные лунки в каждой пластине инокулируйте 2 x 10 в степени трех T.pallidum на миллилитр разведения. Уравновесьте тарелки газовой смесью с низким содержанием кислорода и инкубируйте их в пивоваренной банке или тригазовом инкубаторе при температуре 34 градуса Цельсия. На седьмой день удалите половину среды и замените ее свежей уравновешенной TpCM-2.
После того, как положительные лунки будут идентифицированы с помощью темнопольной микроскопии, трипсинизируйте положительные лунки и перенесите клеточную суспензию на ранее подготовленные 24-луночные планшеты для дальнейшего расширения. T.pallidum обычно сохраняет более 90% подвижности и размножается логарифмически со временем удвоения от 33 до 45 часов в течение примерно семи дней до перехода в неподвижную фазу. В течение одной недели спирохеты претерпели примерно четыре-пять удвоений.
