Для начала приобретите культуральную пластину с колониями Methylomonas вида LW13. Инокулируйте колонии по шесть миллилитров нитратных минеральных солей среды в стеклянную пробирку. Закройте тюбик пробкой из сыворотки и алюминиевым обжимным уплотнением.
Добавьте метан с помощью шприца, чтобы создать конечную атмосферу размером 50% от объема метана в воздухе. Встряхивайте эту планктонную жидкую культуру со скоростью 200 оборотов в минуту при комнатной температуре до мутности, на что уходит около суток. Пропустите жидкие культуры в соотношении один к 10 в свежие среды.
Продолжайте выращивание жидких культур метанотрофов до роста логарифмической фазы, достигая оптической плотности на 600 нанометрах примерно 0,5. Чтобы подготовить шприц, снимите прилагаемые поршни и поместите его в стерильный контейнер. Прикрепите стерильный фильтрующий наконечник из политетрафторэтилена или ПТФЭ к каждому шприцу и поместите шприц в стандартный штатив для пробирок кончиком вниз.
Затем смешайте один миллилитр клеток с пятью миллилитрами нитратной минеральной соли среды и четырьмя миллилитрами расплавленной агарозы в стерильной конической пробирке. Медленно налейте агарозную смесь в шприц до отметки в восемь миллилитров и дайте ей застыть. Примерно через 15 минут закройте шприц стерильной 20-миллиметровой резиновой бутиловой пробкой.
Закрепите пробки лабораторной лентой и промаркируйте шприц. Затем наполните большой 60-миллилитровый шприц 100% метаном и прикрепите наконечник фильтра из ПТФЭ, подключенный к стерильной игле 23-го калибра. Большим шприцем проткните резиновую пробку шприца с агарозной смесью, а в качестве газоотвода вставьте вторую стерильную иглу.
Нажмите на поршень большого шприца, чтобы 20 миллилитров 100% метана промылись через пространство головки. Снимите выпускную иглу, когда в шприце останется один-два миллилитра метана, чтобы предотвратить обратный ток кислорода. Инкубируйте шприц с агарозной смесью и метаном при температуре 18 градусов Цельсия.
Чтобы выдавить агарозу, замените наконечник фильтра из ПТФЭ на стерильную иглу 23 калибра, а резиновую пробку — на плунжер шприца, входящий в комплект поставки. Медленно нажмите на поршень, чтобы распределить один миллилитр с шагом в отдельные стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Дикий штамм LW13 образовывал четкую горизонтальную полосу на определенной глубине в градиентном шприце, где концентрации метана и кислорода были низкими.
LW13, инокулированный в градиентные шприцы, показал метано-кислородный контрградиент с истощением метана и потреблением кислорода, соответствующим глубине горизонтальной полосы. У мутанта делеции OAT LW13 отсутствовало отчетливое образование горизонтальной полосы, наблюдаемое у штамма дикого типа, что указывает на роль гена в этом фенотипе.
