Для начала в колпак для клеточных культур добавьте собранный липоаспират в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Переложите липоаспират в стерильный 20-миллилитровый шприц с замком Люэра. Затем прикрепите к шприцу разъем на 1,4 миллиметра.
Теперь прикрепите второй шприц с замком Люэра объемом 20 миллилитров к контралатеральной стороне разъема. Протолкните жировую ткань из одного шприца в другой около 30 раз. Затем переложите эмульгированный жир в свежую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.
Центрифугируйте жир при 500 г в течение 10 минут. Затем выбросьте жирный верхний слой. Соберите центральный очищенный слой, содержащий отделенный стромальный сосудистый слой, и переложите его в свежую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.
Теперь заполните центрифужную пробирку дополненным DMEM до отметки 40 миллилитров. Снова центрифугируйте пробирку при 500 G в течение пяти минут. Соберите полученный слой mSVF и переложите его в новую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.
В стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра пипеткой введите 100 микролитров выделенной стромально-сосудистой фракции. К этому добавляют 10 микролитров тромбина, затем пипетку 10 микролитров хлорида кальция. Наконец, добавьте в смесь 70 микролитров транексамовой кислоты.
С помощью свежего наконечника пипетки добавьте в пробирку 10 микролитров фибриногена незадолго до нанесения. После полимеризации гидрогелевой смеси mSVF пипеткой 200 микролитров гидрогеля в 12-луночный планшет для аналитических целей. Теперь добавьте 100 микролитров фибринового гидрогеля в одну лунку в качестве отрицательного контроля.
Инкубируйте 12-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе в течение 30 минут. Затем в каждую лунку добавьте по одному миллилитру предварительно прогретой питательной среды. Снова поместите 12-луночный планшет обратно в инкубатор на четыре часа.
Добавьте по одному миллилитру резазурина в каждую лунку перед повторной инкубацией в течение 24 часов. Пипеткой поместите образцы резазурина в 96-луночный планшет. На следующий день используйте многорежимный считыватель микропланшетов для визуализации клеток, чтобы измерить первую интенсивность флуоресценции.
Для гистологического анализа в первый, третий и седьмой дни инкубируйте фибриновый гидрогель в 0,5 мл 4% параформальдегида. Теперь добавьте 1% PBS в тарелку и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Анализ на резазурин проводили для количественной оценки in vitro жизнеспособности клеток сосудистой фракции и гидрогеля.
Сосудистая фракция показала снижение жизнеспособности на третий день, в то время как комбинация mSVF-фибрина гидрогеля оставалась близкой к исходному уровню. К седьмому дню жизнеспособность mSVF снизилась, в то время как комбинация mSVF и фибринового гидрогеля увеличилась. Гистологический анализ не показал уменьшения количества клеточных ядер на третий и седьмой день.
Фибриновый гидрогель продемонстрировал минимальную деградацию с равномерно распределенными видимыми клеточными кластерами.
