Анализ активности фосфатазы для характеристики аллостерической регуляции фосфатаз с помощью рапамицин-регулируемой системы RapR

Для начала необходимо получить HEK293T клеток, экспрессирующих RapR-Shp2, и провести иммунопреципитацию с помощью белка G-сефарозы. После иммунопреципитации промыть сефарозу два раза каждый 0,5 миллилитрами буфера для лизиса, а затем 0,5 мл буфера для промывки. Удалите как можно больше буфера после финального спина.

Затем добавьте 40 микролитров фосфо-паксиллина в буферной смеси имидазола в каждый образец с одним микромолярным рапамицином или без него. Осторожно переверните трубку и сразу же поместите ее в нагревательный шейкер на 40 минут при температуре 32 градуса Цельсия. Установите нагревательный шейкер на 1000 оборотов в минуту, чтобы обеспечить полное перемешивание образца.

Чтобы остановить реакцию, добавьте 40 микролитров 2X Laemmli буфера в каждый образец и инкубируйте их при температуре от 95 до 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. После того, как образцы остынут, загрузите 15 микролитров каждого образца в полиакриламидный гель SDS с градиентом от 4 до 15%. Запустите стандартный протокол вестерн-блоттинга с использованием мембран PVDF.

Наконец, блоттинг с использованием антител анти-FLAG для обнаружения конструкции RapR-Shp2 и антифосфо-паксиллина для обнаружения фосфорилированного паксиллина в образцах. Активный RapR-Shp2 не показал фосфо-паксиллина, аналогичного конститутивно активному Shp2, что указывает на сохраненную полную активность. Неактивный RapR-Shp2 и доминантный негативный Shp2 показали сходные уровни фосфо-паксиллина, что указывает на отсутствие активности в неактивном состоянии.