Подготовка образцов цельной крови для проточной цитометрии и анализа цитокинов для определения антиген-специфического иммунитета хозяина к грибковым и вирусным патогенам

Чтобы начать подготовку образца для проточной цитометрии, достаньте из инкубатора пробирки для стимуляции, содержащие образцы цельной крови с Брефельдином А. Добавьте 500 микролитров 0,5 молярного раствора ЭДТА в каждую стимулирующую пробирку, содержащую Брефельдин А. Перенесите образцы в новые центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров. Затем пипеткой введите один миллилитр буфера для лизиса эритроцитов в каждую стимулирующую трубку, чтобы промыть его.

Перенесите буфер и суспензию клеток в одну и ту же центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирки при 600 г в течение семи минут, и тщательно пипетируйте надосадочную жидкость. Затем добавьте в гранулу буфер для лизиса эритроцитов и повторно суспендируйте его.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре, пока образцы не станут прозрачными, или не более шести минут. Центрифугируйте пробирки при 600 г в течение семи минут. После выброса надосадочной жидкости добавьте в гранулу один миллилитр HBSS.

Переложите клеточную суспензию в двухмиллилитровые реакционные пробирки. Затем центрифугируйте пробирки при 400 г в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость перед выполнением проточного цитометрического окрашивания.

Перенесите образцы из пробирок для стимуляции, которые не содержат брефельдин А, в пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при массе 2 000 г в течение 20 минут. Теперь осторожно пипетируйте надосадочную жидкость в свежую 1,5-миллилитровую пробирку.

Если надосадочная жидкость не анализируется сразу, криоконсервируйте образец при температуре 80 градусов Цельсия. При использовании замороженных образцов центрифуга снова размораживала надосадочную жидкость со скоростью более 7 000 г в течение пяти минут перед анализом. Выполните предварительное разведение образцов в соответствии с протоколом анализа цитокинов.

Ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера защиты РНК. Криоконсервируйте его при температуре 80 градусов Цельсия для последующего выделения РНК. В качестве альтернативы можно повторно суспендировать клеточную гранулу в 700 микролитрах буфера для лизиса для немедленного выделения РНК.